3种圭亚那柱花草根系分泌物对杂草幼苗生长的影响

王俐媛, 王 坚, 丁西朋, 欧芳秀, 李佳旭, 李雪枫*

(1. 热带特色林木花卉遗传与种质创新教育部重点实验室/海南大学林学院, 海南 海口 570228；2. 海南大学动物科技学院,海南 海口 570228；3. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 海南 海口 570228)

植物通过适当的途径向环境释放化感物质，从而直接或间接影响邻近或下茬植物萌发和生长的效应称为植物化感作用[1]，其中根系分泌是化感物质释放的主要途径之一[2-3]。研究已表明，粮食作物可以通过根系分泌途径产生和释放化感物质来抑制杂草种子萌发和生长，如小麦(TriticumaestivumL.)根系分泌的DIMBOA(2,4-二羟基-7-甲氧基-(2H)-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮)能抑制牛筋草(Eleusineindica(L.) Gaertn.)、苣荬菜(SonchusarvensisL.)、宝盖草(LamiumamplexicauleL.)、看麦娘(AlopecurusaequalisSobol.)、鸡眼草(Kummerowiastriata(Thunb.) Schindl.)、小藜(ChenopodiumserotinumL.)、蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)和荠(Capsellabursa-pastoris(L.) Medic.)等8种杂草的生长[4]，水稻(OryzasativaL.)根系分泌的羟基肟酸、环己烯酮、黄酮和二萜内酯等非酚酸类化合物能显著抑制水田杂草稗草(Echinochloacrus-galli(L.) Beauv.)、异型莎草(CyperusdifformisL.)的生长[5]，荞麦(FagopyrumesculentumMoench.)的根系分泌物强烈抑制反枝苋(AmaranthusretroflexusL.)、藜(C.albumL.)和稗草的生长[6]；栽培牧草也可以通过根系释放化感物质抑制杂草的生长，如禾本科牧草多花黑麦草(LoliummultiflorumLam.)的根系浸提液显著抑制稗草、鸭舌草(Monochoriavaginalis(Burm. F.) Presl ex Kunth)、AeschyoaindicaL.、千金子(LeptochloachinensisL.)和丁香蓼(LudwigiaprostrataRoxb.)等5种杂草的根与茎的生长[7]，豆科牧草红豆草(OnobrychisviciaefoliaScop.)的根系分泌物对藜、稗草、反枝苋、白茅(Imperatacylindrica(L.) Beauv.)、狗尾草(Setariaviridis(L.) Beauv.)、野燕麦(AvenafatuaL.)和龙葵(SolanumnigrumL.)等7种杂草的种子萌发和幼苗生长均有抑制作用，且浓度越大抑制作用越明显[8]。因此，利用植物根系分泌物可抑制杂草生长这一特性来生态、安全地防控杂草已成为杂草防控新技术的重要研究内容之一[9-10]。

柱花草(Stylosanthesspp.)刈牧兼用，是世界热带地区种植面积最大、应用最广泛的优良豆科牧草之一[11]。自1962年起，中国先后从马来西亚、哥伦比亚、澳大利亚、巴西等国家引进大量柱花草种质[12-13]，其中圭亚那柱花草(StylosanthesguianensisSw.)是柱花草属中种质资源最丰富的种[13]。采用引种筛选、杂交育种、辐射诱变、细胞工程育种和转基因育种等手段，经过30多年的选育和适应性试验，我国已培育出了热研2号(S.guianensisSw. ‘Reyan No. 2’)等13个经国家草品种审定委员会审定通过的圭亚那柱花草系列品种(由1988—2020年国家草品种审定委员会审定通过的草品种名录整理)。它们具有适应性强、耐干旱贫瘠、抗寒性强、长势好、产草量高等优良特性[14-16]，在人工草地建植、天然草地改良、胶园果园行间覆盖和绿肥等方面具有广泛的应用前景[11]。Khanh等[17]研究指出，柱花草是具有强烈化感作用的植物之一，以柱花草植株为覆盖物可使稻田杂草的生物量减少80%；袁洋等[18]也发现：较高浓度的柱花草水浸提液可抑制狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)和鬼针草(BidenspilosaL.)的种子萌发和幼苗生长。柱花草的根系中也含有丰富的次生代谢产物[19-20]，在遭受胁迫的环境下，其根系中的次生代谢物的含量还会显著增加[19,21]。但目前关于柱花草根系分泌物对杂草生长的化感作用的机制还不清晰，使得人们在利用柱花草的化感作用特点进行高效、可持续的杂草防控方面尚存在困难。因此，本研究通过比较3种圭亚那柱花草品种的根系分泌物对热带地区常见5种杂草幼苗生长的影响，以期初步揭示柱花草根系分泌物对杂草的化感效应，为利用柱花草根系分泌物特征开发生态安全的田间杂草控制策略提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取圭亚那柱花草的3个栽培品种——‘热研2号’、‘热研5号’(S.guianensisSw. ‘Reyan No. 5’)和热研21号(S.guianensisSw. ‘Reyan No. 21’)为供体植物，其中‘热研2号’和‘热研5号’是从CIAT184柱花草群体中筛选出的适合中国热带地区种植的耐寒耐旱优质品种[13]，热研21号则是利用卫星搭载‘热研2号’柱花草种子经空间诱变选育而成的高产抗病品种[11]，3种柱花草种子均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家热带牧草中期备份库提供。选取海南岛危害较为严重的5种入侵杂草——含羞草(MimosapudicaL.)、鬼针草、假臭草(EupatoriumcatariumV.)、羽芒菊(TridaxprocumbensL.)和蒺藜草(CenchrusechinatusL.)[22]为受体植物。杂草的种子均采自于海南大学海甸校区及周边。

1.2 试验方法

1.2.1试供种子催芽处理 根据预试验测算的不同种类种子的发芽时间分批进行催芽处理，以保证各种种子同期萌发。其中，柱花草的种子80℃水浴处理3 min[23]，取出晾凉后再用75%的酒精表面消毒5 min，然后用蒸馏水洗去表面残余的酒精，自然晾干后将种子置于铺有湿润双层滤纸、直径9 cm的培养皿中催芽；受体植物中含羞草种子采取与柱花草种子一致的方式催芽处理，鬼针草、假臭草、羽芒菊和蒺藜草的种子在消毒处理后，直接选取均一饱满的种子置于同等规格的培养皿中。所有培养皿均上盖置于25℃黑暗条件下培养至露白(胚根突破种皮0.5～1 cm)，中途每天开盖添加1 mL蒸馏水。

1.2.2柱花草根系分泌物的收集 参考刘允熙等[23]的研究方法，采用水培法收集3种圭亚那柱花草的根系分泌物。将露白的柱花草种子移植至盛有1/2 Hoagland营养液(pH=5.8)、液面覆双层脱脂纱布的15 mL玻璃管，每管1株柱花草；玻璃管放入上盖有20个孔洞的培养箱中，每孔1个玻璃管，使浸入营养液的根系避光生长。培养箱置于25℃/14 h黑暗、30℃/10 h光照、相对湿度75%的人工气候箱内培养。每天定时向玻璃管内补充营养液，使水培溶液保持在恒定水平。10 d后，收集水培液，用含有柱花草根系分泌物的水培液进行后续试验处理。

1.2.3杂草育苗及根系分泌物影响试验 在收集柱花草根系分泌物的同时，用相同培养方法培养5种杂草。待各杂草幼苗在1/2 Hoagland营养液中生长10 d后，将其中一部分杂草幼苗(90株)从试管中取出，分别转移至上述收集的含有柱花草根系分泌物的玻璃管中继续生长，每株对应一个玻璃管。以一部分杂草幼苗(60株)分别移植到原本生长同种植物的玻璃管中继续生长为对照。每处理设6个重复。

1.2.4指标测定与计算 各杂草植株在含有柱花草根系分泌物的营养液中继续生长7 d后，先用游标卡尺测量每株杂草的株高和根长，计数其侧根数量，然后用感量0.1 mg天平分别称量其地上生物量和地下生物量，计算各杂草的单株总生物量、根冠比、化感效应指数(Allelopathic response index,RI)和化感综合效应(Synthetical effect of allelopathy,SE)。

(1)

其中：T为处理值，CK为对照值，RI>0表示存在促进作用，RI<0表示存在抑制作用，RI绝对值的大小与化感作用强度一致[24]。

(2)

其中：RIR、RIH、RIL、RIRB、RIHB、RITB分别为同一处理下各杂草的根长、株高、侧根数、地下生物量、地上生物量、总生物量的化感效应指数，SE>0表示化感综合效应为促进，SE<0表示化感综合效应为抑制，SE的绝对值越大表示化感综合效应越强。

1.3 数据的处理与分析

实验的数据采用SPSS 21.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行分析，GraphPad Prism 8(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)进行作图。为清晰地呈现出各指标的变化情况，不同圭亚那柱花草根系分泌物处理后各种杂草的根长、株高、侧根数、生物量和根冠比指标均用化感效应指数制图或表。用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)进行不同处理间的多重比较，Duncan法在P<0.05水平进行差异显著性检验。为明确杂草幼苗的不同表型指标变化对圭亚那柱花草根系分泌物化感综合效应的影响程度，以各根系分泌物对5种杂草各个指标的化感综合效应为“参考值”(母序列)，计算6个指标与化感综合效应的关联度，用灰色关联法分析化感综合效应与各生长指标化感效应指数的相关性。

(3)

(4)

2 结果与分析

2.1 圭亚那柱花草根系分泌物对杂草幼苗形态特征的化感效应

2.1.1圭亚那柱花草根系分泌物对杂草根长的化感效应 3种圭亚那柱花草根系分泌物处理对含羞草幼苗的根长均有促进效应，但仅RY2处理的促进效应显著(P<0.05)。3种圭亚那柱花草根系分泌物处理对鬼针草和蒺藜草幼苗的根长均有化感抑制效应，其中RY2和RY5处理下各幼苗根长的化感效应指数间均无显著差异，均比CK显著降低(P<0.05)，而RY21处理下的化感效应指数均与CK无显著差异(图1)。假臭草和羽芒菊幼苗在RY5处理下根长的化感效应指数与其CK均无显著差异，而RY2和RY21处理对其幼苗根长均有显著促进效应(P<0.05)(图1)。

图1 3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下5种杂草幼苗根长的化感效应指数Fig.1 Allelopathic response index of root length of five weeds seedlings treated with root exudates from three varieties of S. guianensis Sw.注：*表示同种杂草在不同根系分泌物处理下与对照差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示同种杂草在不同根系分泌物处理时差异显著(P<0.05)；RY2、RY5和RY21分别表示热研2号柱花草根系分泌物处理、热研5号柱花草根系分泌物处理和热研21号柱花草根系分泌物处理；下同Note:* indicates that the same weed is significantly different from the control under different root exudates (P<0.05). Different lowercase letters indicate the significant differences of the same weed under the treatments of different root exudates (P<0.05). RY2,RY5 and RY21 represent the root exudate treatment of S. guianensis Sw. ‘Reyan No. 2’, S. guianensis Sw. ‘Reyan No. 5’ and S. guianensis Sw. ‘Reyan No. 21’,respectively. The same as below

2.1.2圭亚那柱花草根系分泌物对不同杂草株高的化感效应 RY5根系分泌物处理抑制5种杂草的株高生长，而RY2和RY21根系分泌物处理促进含羞草、羽芒菊和蒺藜草幼苗的株高生长(图2)。其中：RY21处理对含羞草幼苗的株高具有显著促进效应(P<0.05)，化感效应指数为0.25，与RY5和RY21处理间差异显著(P<0.05)；RY2和RY21处理下羽芒菊幼苗株高的化感效应指数间无显著差异，均比CK显著增加(P<0.05)；RY5处理对蒺藜草幼苗的株高具显著抑制效应(P<0.05)，化感效应指数为-0.12，而RY21处理具显著促进效应(P<0.05)，化感效应指数为0.07(图2)。3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下鬼针草和假臭草幼苗株高的化感效应指数间无显著差异，且与其CK均无显著差异(图2)。

图2 3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下5种杂草幼苗株高的化感效应指数Fig.2 Allelopathic response index of plant height of five weeds seedlings treated with root exudates from three varieties of S. guianensis Sw.

2.1.3圭亚那柱花草根系分泌物对不同杂草侧根数的化感效应 3种圭亚那柱花草根系分泌物对含羞草、鬼针草和假臭草幼苗侧根数的化感效应指数均无显著影响，却显著抑制羽芒菊幼苗的侧根数(P<0.05)，且RY21对羽芒菊幼苗侧根数的化感抑制效应显著大于RY2的化感抑制效应(P<0.05)，与RY5的化感抑制效应无显著差异，化感效应指数高达-0.83(图3)；RY2、RY21根系分泌物对蒺藜草幼苗的侧根数无显著影响，但RY5根系分泌物处理使其侧根数显著增加(P<0.05)，化感效应指数为0.30(图3)。

图3 3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下5种杂草幼苗侧根数的化感效应指数Fig.3 Allelopathic response index of lateral root number of five weeds seedlings treated with root exudates from three varieties of S. guianensis Sw.

2.2 圭亚那柱花草根系分泌物对不同杂草生物量积累和分配的化感效应

2.2.1圭亚那柱花草根系分泌物对不同杂草生物量的化感效应 不同杂草幼苗的地下生物量、地上生物量和总生物量对3种圭亚那柱花草根系分泌物的响应具有显著差异(表1)。3种圭亚那柱花草根系分泌物对含羞草幼苗的地下生物量无显著影响，但RY5和RY21处理对其地上生物量有显著抑制效应(P<0.05)，而总生物量仅在RY5处理下比CK显著降低(P<0.05)，化感效应指数为-0.10。3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下鬼针草幼苗的地上生物量和总生物量的化感抑制效应不显著，均与其CK间无显著差异；RY2和RY5处理对鬼针草幼苗的地下生物量有显著促进效应(P<0.05)，化感效应指数分别为0.24和0.33。3种圭亚那柱花草根系分泌物对假臭草幼苗的地上生物量和总生物量的化感效应不显著，RY2和RY5处理对假臭草幼苗的地下生物量有显著抑制效应(P<0.05)，化感效应指数均为-0.41，但RY21处理对其地下生物量有显著促进效应(P<0.05)，化感效应指数为0.35。除RY5根系分泌物处理对羽芒菊幼苗的地下生物量有显著抑制效应外(P<0.05)，其他根系分泌物处理对羽芒菊的地下生物量、地上生物量和总生物量均无显著影响。3种柱花草根系分泌物处理对蒺藜草幼苗的地下生物量、地上生物量和总生物量均有抑制效应，但RY2处理的抑制效应不显著，RY5处理的抑制效应均显著(P<0.05)，化感效应指数分别为-0.47，-0.17，-0.20，RY21处理仅对其地下生物量的抑制效应显著(P<0.05)(表1)。

表1 3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下5种杂草幼苗单株生物量的化感效应指数Table 1 Allelopathic response index of seedling biomass per plant of five weeds treated with root exudates from three varieties of S. guianensis Sw.

2.2.2圭亚那柱花草根系分泌物对不同杂草根冠比的影响 3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下含羞草和鬼针草幼苗的根冠比的化感促进效应不显著，均与其CK间无显著差异(图4)；RY2和RY5处理对假臭草幼苗的根冠比均有显著抑制效应(P<0.05)，化感效应指数分别为-0.40和-0.39，RY21处理对其根冠比具化感促进效应，但促进效应不显著；羽芒菊和蒺藜草幼苗在RY5处理下的根冠比均比CK显著降低(P<0.05)，化感效应指数分别为-0.42和-0.35，而在RY2和RY21处理下其根冠比与其CK间均无显著差异(图4)。

图4 3种圭亚那柱花草根系分泌物处理下5种杂草幼苗根冠比的化感效应指数Fig.4 Allelopathic response index of root-shoot ratio of five weeds seedlings treated with root exudates from three varieties of S. guianensis Sw.

2.2.3圭亚那柱花草对不同杂草的化感综合效应 3种圭亚那柱花草根系分泌物对含羞草幼苗生长的总化感综合效应为促进，对假臭草、鬼针草、羽芒菊和蒺藜草幼苗的总化感综合效应均为抑制，其中RY2、RY5和RY21对含羞草的促进效应间无显著差异、对鬼针草的抑制效应间也无显著差异，而RY2对蒺藜草的抑制效应显著弱于RY5和RY21(P<0.05)，RY21对假臭草幼苗的化感综合效应为促进，RY2对羽芒菊幼苗的化感综合效应为促进(表2)。RY2、RY5和RY21根系分泌物对5种杂草幼苗的化感综合效应间均存在显著差异(P<0.05)，其中RY2和RY5根系分泌物对5种杂草幼苗生长的总化感综合效应均为抑制效应，分别为-0.10和-0.48，而RY21根系分泌物对5种杂草幼苗生长的总化感综合效应为促进(0.10)(表2)。

表2 不同圭亚那柱花草根系分泌物影响下5种杂草的化感综合效应Table 2 Synthetical effect of allelopathy of five weeds treated by different S. guianensis Sw. root exudates

2.3 各生长指标的化感效应指数与化感综合效应的相关性分析

测定的6个生长指标中，总生物量、地上生物量和株高可以较大程度反映杂草生长状况受圭亚那柱花草根系分泌物的影响程度，与根系分泌物化感综合效应的关联度分别为0.855，0.848，0.835，根长、地下生物量和侧根数的化感效应指数与化感综合效应的关联度均大于0.6，但数值依次减小(表3)，说明这3个指标也有一定的参考意义，但在表征各杂草对不同柱花草根系分泌物的化感响应时逐渐趋于不敏感。

表3 化感综合效应与各生长指标化感效应指数的相关性Table 3 Correlation between synthetical effect of allelopathy and allelopathic response index of growth indexes

3 讨论与结论

植物可以通过根系分泌途径释放的化学物质与周围植物及其他有机物发生复杂的化学作用[25]，这些物质主要包括糖类、氨基酸、有机酸、酚酸等低分子化合物、粘液等高分子化合物和其他初生、次生代谢物[26]，一般把在植物与植物种间起化学抑制或促进作用的低分子化合物称为化感物质(allelochemical)[1]，化感物质与其化感作用对象之间具有一定的选择性和特异性[27-28]。本研究发现，同种柱花草根系分泌物对不同种杂草幼苗的影响情况不同，其中热研5号柱花草根系分泌物对羽芒菊、蒺藜草和假臭草幼苗的生长有较强抑制作用，对鬼针草和含羞草幼苗的影响较弱；热研2号柱花草根系分泌物对假臭草化感综合效应为抑制作用，对羽芒菊的化感综合效应为促进作用。这与Zhang等[4]研究小麦根系分泌物、李瑞华等[8]研究红豆草根系分泌物对不同种杂草的化感作用不同这一结论基本一致。本试验中柱花草化感作用的5种受体杂草均为外来入侵植物归化逸生后在海南岛广泛分布，其中含羞草是豆科多年生亚灌木状草本植物，假臭草和鬼针草为菊科一年生草本植物，羽芒菊为菊科多年生草本植物，而蒺藜草为禾本科一年生草本植物[22]，说明柱花草根系分泌物对杂草的化感作用也具有选择性，与受体杂草各自的遗传背景、进化历史以及是否是该生境本土植物有关。长期邻近生长的植物之间适应彼此释放的化感物质而共存生长，新的植物进入该生境必然会遭到原生植物释放的化感物质不同强度的干扰[29]，入侵植物也会释放自身的化感物质抑制原生植物的生长[30]，最终的生长情况是二者互相的化感作用及其种间竞争等多种因素共同作用的结果。3种柱花草根系分泌物对含羞草的综合化感效应均为促进作用，可能是由于含羞草与柱花草同属于豆科植物，本身也具有较强的化感作用和入侵性[31]，对柱花草根系分泌物的影响不敏感，还需要进一步的实验验证。

本试验中热研5号柱花草根系分泌物对5种杂草主要表现为化感抑制效应，且其化感效应强于热研2号和热研21号柱花草，这与孔垂华[10]研究不同品种小麦、水稻化感作用及李志华和沈益新[32]研究紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的化感作用所得到的结果一致，即作物的化感作用强度与供体植物的具体品种有关。牧草栽培种大多由野生近缘植物经人工栽培和选育逐步演化而来，每种牧草都有众多不同驯化程度的种质资源，但并非同一牧草的任意品种均能表现出化感作用。3种圭亚那柱花草根系分泌物的化感潜力存在差异的原因可能在于两个方面：一是不同品种释放的化感物质种类和浓度不同造成的[10,32]；二是根系分泌物释放进入生长基质(土壤、营养液等)后会受到土壤微生物活性、基质理化反应和代谢作用的干扰[33]。本研究中，我们通过在人工气候箱内收集含有柱花草根系分泌物的营养液来培养各杂草幼苗，使杂草生长不受外界环境及其他植物竞争等的影响，可最大限度地反应根系分泌物的本质。但是，营养液培养法收集的根系分泌物与自然条件下植物根系分泌物间必然有一定差异，而且根系只是化感物质的释放通道而不是化感物质的合成场所[34]。有研究发现，根系中含有柠檬酸、苹果酸等有机酸类次生代谢产物[19-20]，当柱花草遭受生物、非生物胁迫时，柱花草根系的次生代谢产物含量会发生显著变化[21,35]。由此可推测，其释放至环境的化感物质必然也会显著变化。因此，为进一步明确柱花草根系分泌物对杂草生长的化感作用，还应进行土壤栽培条件下圭亚那柱花草与杂草的生长干扰情况等的研究，而且根据本研究灰色关联分析的结果，在进行柱花草化感效应的生物响应情况研究中，应重点关注总生物量、地上生物量和株高这3个生长指标。

综上所述，3种圭亚那柱花草根系分泌物对含羞草幼苗生长无显著化感效应，对鬼针草、蒺藜草、羽芒菊和假臭草这4种杂草的总化感综合效应均为抑制作用，但热研21号柱花草根系分泌物对杂草抑制能力最弱，热研2号柱花草次之，而热研5号柱花草根系分泌物除鬼针草的地下生物量外，对5种杂草的株高、地下生物量、地上生物量和总生物量均有化感抑制效应，说明人工草地建植中可以应用热研5号柱花草及其根系分泌物进行杂草管理和天然除草剂的开发，从而保障牧草产量增收和生态环境安全。