烟草MRS2/MGT基因家族的鉴定与表达分析

吴 题，魏晓玲，冯常青，黄云侠，徐时长，邱福祥，郑英洁，李文卿，何华勤

（1福建农林大学生命科学学院，福州 350002；2福建省烟草专卖局烟草科学研究所，福州 350003）

0 引言

镁作为仅次于氮、磷、钾的植物第四大营养元素，在提高植物抗逆性方面有重要作用。长期以来，南方红壤地区由于高温、多雨等原因，含镁矿物受到风化、淋洗等作用，造成土壤中的有效性镁含量降低[1-2]。镁缺乏已成为限制国内农业生产中作物产量的重要因子，合理施用镁能有效提高作物产量、改善品质、提升抗逆境胁迫能力[3-4]。镁的运输与分配离不开镁转运蛋白，前人发现细菌中有3种不同类型的镁离子转运蛋白，即钴抗性A基因(CorA)、镁转运基因(MGT)A/B和MGTE[5-7]。植物中MGT是CorA亚家族中的一类。研究人员已从水稻、甘蔗、玉米、甘蓝型油菜、巴西橡胶树等植物中鉴定出镁转运蛋白基因家族[8-12]。在拟南芥中，鉴定出的镁离子转运蛋白基因家族有10个成员和1个假基因(AtMRS2-9)，并被命名为AtMGT基因或AtMRS2[13]。对AtMGT基因家族研究较为深入的是AtMGT1基因，该基因蛋白定位于质膜并参与根中镁离子的吸收，且对镁离子具有高亲和性和专一性，能转运土壤中符合生理浓度范围的镁离子，也能转运其他的二价阳离子，但对其他二价阳离子的转运要求其浓度高出土壤生理浓度[14]。AtMGT6是一种质膜局部转运蛋白，可以介导局部镁离子吸收和低镁耐受性，主要与环状核苷酸门控通道(CNGC)家族蛋白AtCNGC10协同吸收并转运拟南芥根中的镁。在水稻中，研究人员已鉴定出9个镁离子转运蛋白基因家族成员。OsMGT1是首个被克隆的水稻MRS2/MGT类基因，其位于质膜中，参与Mg2+的吸收且介导根部的镁运输[9,15-16]。目前，对植物中MGT家族基因的研究仅有少数报道，而对烟草中MGT家族成员的鉴定与功能研究尚未见报道。笔者从烟草基因组中鉴定出镁转运蛋白基因MGT，分析不同镁浓度与光强处理下烟株不同组织部位镁含量与镁转运蛋白基因表达量的关系，以期探究MGT对烟株镁离子运输的机制，为提高烟草的镁营养提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料和实验处理

实验于2020—2021年在福建省烟草专卖局烟草农业科学研究所进行。选用烟草‘翠碧一号’为实验材料。烟草植株培养至七叶一心后移栽至1000 mL的水培罐(12 cm×8 cm×11 cm)中，加不同镁浓度的Hoagland营养液。营养液中的镁(Mg2+)浓度梯度设置为0、12.0、48.0、120.0 mg/L。为模拟福建烟区2—6月的气温跳跃式上升的情况，结合往年福建烟区的气象资料，在烟苗移栽前期和团棵期（移栽后38天）分别设置了18、33℃（高温）2个阶段的温度。烟苗移栽前期人工气候室的温度设定为18℃，湿度为80%，光照强度为160 µmol/(m2·s)(8:00—24:00)和0 µmol/(m2·s)(0:00—8:00)。待烟苗生长至团棵期时，将温度设定为33℃，湿度保持不变，设置2种光照处理，一种是高温正常光照，即光照强度为600µmol/(m2·s)24 h，另一种是高温强光，即光照强度为1200µmol/(m2·s)24 h。利用照度计（美国Kestrel公司，DRM-FQ）测定到达叶片表面的光照强度，以保证到达烟草叶片的有效光照强度。

经过不同镁浓度与光强处理6天后，烟株间出现明显差异，各处理下分别取3株长势相同的烟株，并将它们的第2、3叶位的叶片剔除主脉后剪碎混合均匀，同时把相同处理下的3株长势相同的烟株的根系剪下混匀，分别打包速冻后于-80℃冰箱中冷冻保存，用于MGT基因表达量分析。

1.2 烟株不同部位镁含量的测定

镁的测定采用ICP-AES法。ICP仪的高频功率为1150 W、等离子气流量10 L/min、辅助气流量0.5 L/min、载气流量0.5 L/min、泵转速45 r/min，工作气体为纯度大于99.99%的氩气，观测方式为垂直观测。标准储备液均为100µg/mL。分析波长为280.270 nm。

1.3 烟株基因组中镁转运蛋白基因筛选

从NCBI网站上下载拟南芥和水稻的MRS2/MGT基因家族成员蛋白序列作为query序列，以白肋烟‘TN90’的Ntab-TN90参考注释版本(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?)与 Sol Genomics Network网站的烤烟‘K326’数据库(https://solgenomics.net/tools/blast/?db_id=236)为目标数据库进行BLAST，整合2个数据库的比对结果。使用DNAMAN[17]软件进行氨基酸序列分析，利用ORF Finder软件(http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/gorf.html)对开放阅读框进行预测，利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)对得到的序列进行Motif基序预测，用在线预测网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对序列存在的结构域进行分析，利用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)进行蛋白跨膜结构域(TM)的预测。MGT蛋白的氨基酸数目、分子量等理化性质的分析利用在线预测软件(https://web.expasy.org/protparam/)。利用亚细胞定位预测在线网址(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)对蛋白质进行亚细胞定位分析。用MEGA 7.0[18]根据Neighbor-joining法，重复1000次构建烟草、拟南芥和水稻MRS2/MGT基因序列的系统进化树。

1.4 烟株MRS2/MGT基因家族的表达量分析

使用Takara公司的RNA提取试剂盒对经过不同镁浓度与光强处理的烟株叶片与根部样品进行RNA的提取，反转录为cDNA，并保存于-20℃冰箱中，用于MRS2/MGT基因家族的表达量分析。引物的设计利用Primer 5软件[19]进行，以β-actin为内参基因，引物序列信息如表1所示，而后进行实时荧光定量PCR(QPCR)分析。

表1 NtMRS2/MGT基因QPCR验证所用的引物

2 结果与分析

2.1 烟草MRS2/MGT基因家族的鉴定及其进化分析

由于烟草基因组数据尚不完整，因此利用Sol Genomics Network网站的烤烟‘K326’数据库与NCBI网站的白肋烟‘TN90’的数据库同时进行比较分析。以拟南芥与水稻的MRS2/MGT基因家族成员的蛋白序列作为参考序列，在以上2个数据库中分别进行搜索比对，将在2个数据库中得到的序列进行整合，并进行跨膜结构域、MRS2结构域与基序(Motif)的预测，同时含有MRS2结构域、2个跨膜结构域(TM)，并且在靠近C端的第一个跨膜结构域的末端附近共享一个保守的Gly-Met-Asn(GMN)三肽基序，被认为是MRS2/MGT基因家族的成员，预测结果显示同时满足以上3个条件的序列有7个，分别命名为NtMGT1～NtMGT7（表2）。其中NtMGT5基因有2种可变剪接形式的蛋白质，本研究仅对第一种形式的蛋白质序列加以分析。

表2 NtMRS2/MGT基因信息表

对上述鉴定获得的烟草MGT蛋白的理化性质进行预测，结果如表3所示。烟草MRS2/MGT基因家族成员编码的蛋白质氨基酸数目为372～499，相对分子质量为41.71～54.95 kDa，理论等电点值处于4.83～6.09之间。对烟草MGT蛋白进行亚细胞定位，发现4个MGT成员定位于质膜，3个MGT成员定位于叶绿体。说明烟草MGT蛋白的功能主要是维持质膜与叶绿体中镁离子的平衡。相似性结果分析表明，NtMRS2/MGT蛋白家族的序列相似性处于15.23%～88.60%，其中NtMGT2与NtMGT3相似度最高（表4）。

表3 NtMRS2/MGT蛋白特征

表4 NtMRS2/MGT各成员之间相似度 %

将烟草7个MRS2/MGT基因的蛋白序列进行比对，并分析其氨基酸保守位点，结果如图1所示。7个烟草MGT蛋白都含有镁转运蛋白保守的Gly-Met-Asn(GMN)三肽基序（图1中用红框标记），这与其他植物中MRS2/MGT基因的序列特征相符。利用TMpred的跨膜域分析结果，表明NtMGT1、NtMGT2、NtMGT3、NtMGT6与NtMGT7有2个跨膜结构域，NtMGT4与NtMGT5有3个跨膜结构域，所有NtMRS2/MGT近C端都有2个疏水跨膜域（图2）。

图1 NtMRS2/MGT蛋白序列比对

图2 NtMGTs的跨膜结构域

水稻、拟南芥和烟草MRS2/MGT的系统进化树分析结果见图3。MRS2/MGT基因家族可分为5个亚族，除在D亚族中无烟草MRS2/MGT基因外，在其他亚族内均有烟草MRS2/MGT家族成员。在A和C亚族中各有2个烟草MRS2/MGT旁系同源基因，在拟南芥、烟草与水稻分离之后，在烟草内发生了重复事件。B和E亚族中各有1个烟草直系同源基因。

图3 烟草、拟南芥与水稻基因组中MGTs蛋白质的系统进化树

2.2 不同处理下烟株不同部位镁含量分析

镁是多种酶的活化剂，其含量变化会影响烟草产量和品质。在本研究中，烟株镁含量的变化趋势如表5所示。无论是高温强光还是高温正常光处理，随着镁离子供应浓度的增加，烟株地上部和地下部的镁含量均显著提高。在相同镁离子浓度供应下，强光处理烟株地上部的镁含量显著低于正常光处理，其中L1200Mg0比L600Mg0处理的降低了58.74%，L1200Mg12比L600Mg12处理的降低了37.84%，L1200Mg48比L600Mg48处理的降低了23.18%，L1200Mg120比L600Mg120的处理降低了31.29%。在Mg2+48.0 mg/L时，高温强光与高温正常光处理下烟株地上部镁含量的差异减小。另一方面，镁供应浓度的增加使得高温强光或高温正常光处理下烟株地下部镁含量显著增加。在相同镁离子浓度下，光照对处理下烟株地下部镁含量的影响基本与地上部相似，除了在Mg2+48.0 mg/L时强光处理烟株地下部镁含量显著高于正常光处理的。以上结果表明，提高镁离子供应能增大烟株地上部和地下部镁含量。而强光会抑制烟株对镁的吸收，但适宜的镁离子供应能促进强光下烟株对镁的吸收。

烟株镁含量与镁浓度、光强以及镁浓度和光强交互作用的方差分析如表5。镁离子供应浓度、光强及镁供应和光强交互对烟株地上部镁含量的影响均达显著性水平；不同镁离子供应浓度对烟株地下部镁含量影响不显著，但光强及光强与镁供应浓度的交互对烟株地下部镁含量的影响均达到显著性水平。说明改变镁离子供应浓度、光强均能影响烟株地上部和地下部的镁含量，两者的互作也显著影响镁含量。

表5 不同镁浓度与光强处理下烟株的地上部和地下部镁含量 g/kg

2.3 烟草不同部位MRS2/MGT基因的表达量分析

应用荧光定量PCR技术分析不同处理下烟株地上部和地下部MRS2/MGT基因的表达情况，结果如图4所示。随着镁供应浓度的升高，正常光处理下烟株根中NtMGT1的表达量表现为先下降后上升的趋势，而强光处理下却呈缓慢上升趋势；当镁(Mg2+)供应浓度为48.0 mg/L时，强光处理下烟株NtMGT1基因的表达量显著高于正常光处理；而且不同处理下烟株根中NtMGT1的表达量与其地下部镁含量的变化趋势基本一致（图4A）。由图4B～D可见，烟株叶片中NtMGT2、NtMGT4与NtMGT5的表达量随着镁供应浓度的升高呈现先上升后下降的趋势，在镁(Mg2+)供应浓度为48.0 mg/L时达到最大值。同时，强光处理下这3个基因的表达量高于正常光处理。

图4 不同镁供应浓度与光强处理下烟株根和叶中NtMGT基因的表达量

3 结论与讨论

植物镁离子转运蛋白具有吸收、转运、维持镁离子稳态等的作用，因此对植物生长发育有重要的影响[20]。笔者首先应用同源序列比对策略，从烟草基因组中鉴定出7个NtMGTs家族成员，且各成员在近C末端均有典型的GMN基序。系统进化分析显示该基因家族与拟南芥、水稻的分离后，在烟草基因组内可能发生了重复事件[21-22]。

本研究发现烟株MRS2/MGT基因的表达具有组织特异性。在不同镁供应浓度与光强处理下，烟株叶片中NtMGT2、NtMGT4与NtMGT5基因，根中NtMGT1基因的表达均出现显著性差异。前人研究也获得相同结论。AtMGT10主要在成熟的拟南芥维管组织或者幼嫩的叶片中表达，介导叶绿体中镁的转运以提高叶绿体中的镁含量[23]。研究人员在拟南芥角果中发现AtMGT2、AtMGT4、AtMGT6、AtMGT9的表达，而在种子中仅发现AtMGT2有表达。水稻MGTs基因的表达主要在芽和愈伤组织中[24]。本研究还发现，在强光处理下，NtMGT1基因在根中的表达量逐渐上升，且与在根系中镁含量的变化趋势一致，说明强光处理下烟株可能通过提高NtMGT1基因的表达量来提高烟株根系对镁离子的吸收能力，以增加根系中的镁含量。前人也发现拟南芥根对镁的吸收主要由AtMGT1等介导完成[25]。以上结果表明，烟株NtMGT1基因主要在根系表达，且强光下其表达量上调，促进烟株吸收更多的镁离子。随着镁供应浓度的升高，烟株叶片中NtMGT2、NtMGT4与NtMGT5基因的表达量呈先升高后降低的趋势，可能是因为这3个基因属于烟草的高亲和镁离子转运系统，在外界镁浓度较低时，基因表达量提高，对镁离子的转运能力加强，而在镁离子浓度较高时(Mg2+120.0 mg/L)，表达量降低，可能在此时主要由低亲和镁离子转运系统起作用。在强光下，当镁离子浓度等于或者高于48.0 mg/L时，NtMGT2、NtMGT4与NtMGT5基因的表达量显著高于正常光处理，说明烟草镁转运蛋白的表达受光诱导。前人在对橡胶树与拟南芥的MGTs基因的研究发现，在成熟橡胶树叶片中，中午光照最强时，HbMGT10的表达量是夜晚的3倍，在拟南芥中AtMGT10受到光诱导后表达量也提高2倍[26]。强光诱导NtMGT2、NtMGT4与NtMGT5基因表达量增加，使得对Mg2+的转运能力增强。而且NtMGT2的亚细胞定位分析显示其定位于叶绿体，暗示NtMGT2可能在强光下介导叶绿体镁离子的转运。

总之，本研究鉴定到烟草基因组中7个MRS2/MGT家族成员，其中NtMGT1在烟株根系中特异性表达，而NtMGT2、NtMGT4、NtMGT5在叶片中特异表达，而且其表达受到光诱导。研究结果可为在烟株高温强光时期合理施用镁肥的生产实践提供理论指导。但目前对于烟草MGT基因家族的研究仅仅是管中窥豹，关于烟草镁离子转运蛋白的特性、表达规律等都尚待探究，而在高温强光下镁离子是如何被烤烟根部吸收，通过何种途径在木质部运输以及如何在烤烟内部进行分配等分子机制都不得而知。因此，对NtMGT基因家族的研究还需要大量细致的工作，以解释在高温强光下烤烟内部的镁离子是如何被吸收转运以及分配的，为在生产上如何合理施用镁肥以缓解高温强光对烤烟的伤害，提高烟草的产量与品质提供理论指导。