磁响应纳米材料在骨组织工程中的应用

苏之文， 吴德光， 李东泰， 吴友辉(综述)， 于 博(审校)

骨组织是人体的重要组成部分，具有保护器官、维持电解质平衡、自我修复的功能[1]。高能量创伤、软组织缺损、骨膜剥离、感染或肿瘤切除等均可造成严重的骨缺损或骨折不愈合[2]。目前常见的治疗有自体骨及异体骨移植、诱导膜技术、Ilizarov技术等[3-4]。传统治疗方式存在自体骨数量有限、免疫排斥、疾病传播、感染、重建期长等问题[5-7]。骨组织工程利用工程学与生命科学的原理，通过结合生物活性分子、细胞、生物材料构建仿生支架充当骨替代物，修复骨缺损，是未来临床治疗骨缺损和骨折不愈合的新方法。磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)是一种新型的纳米材料，除具有传统纳米材料的优点外，还有特殊的磁响应性及超顺磁性，可受外磁场调控。磁响应纳米材料结合了MNPs与其他纳米材料的特性，弥补了单一纳米材料的不足，提升了纳米材料的综合性能，在骨组织工程中有巨大的研究空间及应用前景。本文通过对比传统纳米材料，总结了MNPs的优点、制备方法及分类，就磁响应纳米材料在骨组织工程中的应用现状和发展前景作一综述。

1 磁响应纳米材料的优点与应用现状

组织工程概念的提出为临界尺寸的骨缺损修复提供了新的思路与方法。骨缺损超出临界范围时，骨缺损常难以自我愈合。生物支架材料的植入不仅为骨缺损提供力学支撑，还能引导骨组织再生。虽然传统的纳米材料具有良好的机械性能，能够促进骨组织及周围骨生长最终降解并被新生骨取代，但是会损伤细胞黏附、增强细胞毒性。磁响应纳米材料是由MNPs与其他纳米材料复合而成，受电磁场影响，已被广泛应用于骨组织工程、药物及基因传递、磁共振成像、磁热疗、生物传感器、组织修复等多个领域[8-13]。

1.1体积小，表面易于修饰，可有效结合细胞及化学分子等物质 磁响应纳米材料具有体积小、比表面积大、化学物理状态不稳定、易氧化团聚、摄取效率低、无法有效标记细胞等特点。Shelat等[14]利用精氨酸和组氨酸共同修饰Fe3O4纳米粒，并发现其毒性最小、摄取率较高且能进行体外MRI成像。因此，通过表面修饰来提高MNPs稳定性和摄取率也是目前较为常见的改性方法。

1.2具有超顺磁性，可被外界电磁场调控，成像信号强 与传统纳米材料相比，MNPs在没有外磁场时，不会表现出磁性；当外磁场存在时，容易磁化，感生出与磁场同方向的磁化强度；当去除外磁场时，磁性很快就会消失。Gervits等[15]证明氧化铁纳米粒是有效的磁共振造影剂，并探究不同表面修饰的氧化铁纳米粒的磁性差异。

2 MNPs的制备

不同的MNPs制备方法、条件等可以调控其理化性质，较为精确地控制复杂的纳米结构，提高制备的精度和可重复性。目前较为常见的MNPs制备方法主要为共沉淀法、水热合成法、溶剂热法、溶胶-凝胶合成法、多元醇溶剂法和热解法等。Rasouli等[16]通过水热合成法制备具有核壳结构的Fe3O4/金纳米粒用于药物递送。Marycz等[17]利用溶胶-凝胶合成法成功制备具有抗炎、成骨等作用的α-Fe2O3/γ-Fe2O3纳米粒子。不同的制备方法特点各异，根据设计选择合适的制备方法，不断地改进和完善，调控MNPs的理化性质，体现不一样的效果，丰富其在骨组织工程中的应用。

3 磁响应纳米材料分类

根据选择基底不同，磁响应纳米材料的基底主要有金属、陶瓷及聚合物。金属或合金纳米颗粒具有独特的物理化学性能，除了铁外，常用的还有金、银、钛、钴铬合金等。Ansari等[18]成功合成具有良好的细胞相容性、体外降解性、抑菌活性及矿化能力的超顺磁性纳米结构的CuZnMg混合尖晶石铁氧体。陶瓷材料中金属氧化物、磷酸钙和玻璃陶瓷较为常见，而聚合物是由重复的结构连接而成的高分子量化合物，加入MNPs可让陶瓷、聚合物具有磁响应性能。Cojocaru等[19]采用共沉淀法制备具有良好生物相容性的以聚合物、磷酸钙、MNPs为基础的磁响应纳米复合材料。材料基底的选择没有统一标准，通过不断改进，改善MNPs的稳定性、分散程度及理化性质等，最终提高细胞生物相容性，促进细胞黏附、增殖与成骨分化能力。

4 磁响应纳米材料在骨组织工程中的应用

4.1磁响应纳米材料的生物安全性 有研究表明，生物材料的理化性质如大小、形状、纯度及表面电荷等对生物安全性起重要作用。Rafieepour等[20]通过对比磁性氧化铁微粒(>5 μm)与磁性氧化铁纳米粒(<100 nm)发现纳米结构更有利于细胞吞噬，但比微粒具有更大的毒性。低浓度时，MNPs经过正常代谢途径从体内排出，当纳米粒浓度暴露>50 μg/ml和时间>24 h时，细胞活性降低，活性氧增加，细胞膜电位降低，导致细胞凋亡。目前，MNPs表面易于修饰，其制备工艺成熟，且理化性质易于调控，因此在其应用过程中，大大降低细胞毒性。Zhang等[21]利用氧化石墨烯修饰Fe3O4纳米粒，发现其能降低活性氧含量，提高干细胞活性。然而经过表面修饰后并非都能降低细胞毒性，Krlovec等[22]制备出巯基化二氧化硅包覆的Fe3O4破坏肌动蛋白微丝和细胞骨架，降低细胞黏附水平。这表明磁响应纳米材料用作医疗时，需要彻底了解其细胞毒性及对细胞行为的影响。

4.2磁响应纳米材料与外磁场反应 研究发现不同强度的磁场作用于骨细胞所带来的生物学效应不一，500 nT的亚磁场抑制连接子蛋白43基因的表达，阻止了细胞间的信号传递，显著促进破骨细胞的形成[23]。16T的强磁场促进骨细胞的增殖，抑制破骨细胞的生成。周延峰等[24]为探究不同频率的电磁场对骨密度的影响，将大鼠予以90 min/d的1.8 mT正弦交变电磁场干预，发现15 Hz、45 Hz的电磁场能通过促进成骨活动相关因子的表达，显著提升骨密度。综上所述，通过调节磁场强度及频率等特性可以促进细胞增殖分化、黏附迁移、影响细胞膜及细胞形态、基因表达等，从而促进骨修复，加速骨愈合。由于电磁场的参数可调，影响因素有差异，导致各作用的产生机制不同。电磁场作为一种非侵入的物理疗法，与磁响应纳米材料结合，在骨组织工程中拥有更广阔的应用前景。

4.3磁响应纳米材料参与干细胞移植 近年来，除支架和活性分子外，干细胞因具有分化、刺激组织修复等特性，成为种子细胞。然而，骨缺损部位的不稳定环境及干细胞移植后的存活率低等问题，导致干细胞应用受限，因此需要监测体内干细胞移植后的排斥反应与细胞状态。磁粒子成像(magnetic particle imaging,MPI)是一种新兴的分子成像技术，可以无创检测和量化体内铁氧化物标记细胞。Wang等[25]设计一种边长为22 nm的立方氧化铁纳米粒，磁化强度大、矫顽力小、细胞摄取率高、具有MPI的高灵敏度和分辨率，能实时、长期监测移植后的干细胞。Nejadnik等[26]利用MPI成功检测并定量体内的氧化铁纳米粒标记的干细胞。综上所述，磁响应纳米材料作为干细胞移植后的监测工具，通过不断改进，为临床应用提供新的预测。

4.4磁响应纳米材料递送成骨活性分子 将载药MNPs预加载到支架上，通过磁场控制MNPs实现药物的靶向传递与控释，同时提高药物疗效并延长作用时间，降低全身毒性。此外可通过对磁响应纳米材料的修饰及分子结合，提高其生物相容性及特定靶点。Li等[27]成功制备负载姜黄素、超顺磁性氧化铁纳米粒的唑来膦酸固定的聚乳酸-乙醇酸纳米粒，具有骨和磁双靶向，抑制核因子-κB信号通路的激活，阻止破骨细胞形成和纳米粒诱导的骨溶解。Guo等[28]利用阿伦磷酸钠修饰聚乳酸-乙醇酸基底，负载雌二醇及Fe3O4纳米粒，在外磁场作用下，具有骨靶向及控制释放能力，改善骨丢失，提高骨强度，促进新骨形成。总之，MNPs是一种有效的驱动器，外磁场是一种开关，一起以非侵入和远程方式靶向传递并控制药物释放，促进骨形成。靶向药物运输将活性分子运输至目的部位，不会增加健康组织中的浓度，具有定位准确、毒副作用小、针对性强的优点，可能成为新的治疗手段。

4.5磁响应纳米材料递送成骨相关基因 传统常用的基因载体有病毒类与非病毒类载体。病毒类载体容量小、高成本，具有致癌与感染风险，而非病毒类载体具有转染效率高、细胞毒性大、溶解性差、需改性或功能化修饰等特点。磁转染是将目的基因与MNPs结合形成磁性复合物，能缩短转染时间，提高转染效率和细胞活力，可在电磁场影响下靶向传递，相比病毒类载体更为安全且不会破坏细胞膜。Brett等[29]利用编码Bcl-2基因和绿色荧光蛋白质粒、聚β-氨基酯、聚乙烯亚胺包裹MNPs，在电磁场作用下高效转染脂肪干细胞，上调Bcl-2的表达，促进体内骨再生。Rohiwal等[30]证明聚乙烯亚胺修饰的MNPs是一种有较好前景的传递系统，能提高基因编辑的安全性和实用性。根据目前的研究，磁响应纳米材料无论作为转染试剂还是基因载体，提高了转染的效率及可控性。但是基因搭载的磁响应纳米材料研究更多用于体外阶段，而且制备复杂，因而导致应用受限。

4.6磁响应纳米材料调控免疫微环境 巨噬细胞在骨组织的微环境中起到了重要的调控作用。当生物支架进入体内，机体免疫系统通过Toll样受体的识别促进骨髓来源的巨噬细胞在早期分化为M1型巨噬细胞并分泌炎性细胞因子启动炎症反应。随后，M2型巨噬细胞分泌相关细胞因子，参与免疫调节及组织修复过程。Chen等[31]发现聚乙二醇包覆的超顺磁性氧化铁纳米粒能通过调节Toll样受体4以浓度依赖的方式抑制脂多糖诱导的早期炎症反应。随着时间推移，机体逐渐从非特异性免疫转为特异性免疫，细胞间通过直接或间接接触分泌细胞因子、生长因子、趋化因子等调节宿主反应。当组织受损部位的巨噬细胞激活，持续的炎症反应导致巨噬细胞融合，血管开始增生，免疫细胞的分泌不断促使组织修复。Wang等[32]将磁性M型六角形铁氧体纳米粒植入羟基磷灰石/壳聚糖支架中，招募内源性干细胞，掺入镧后可促进M2型巨噬细胞极化，调节宿主-支架免疫反应，并促进成骨分化。

4.7磁响应纳米材料促进新生血管形成 血管内皮细胞迁移、增殖后形成的血管网格系统，能将营养物质运输到骨缺损部位中从而促进骨组织愈合。细胞因子疗法是促进血管再生有效的策略，但细胞因子半衰期短且在体内易于降解和失活。Wu等[33]发现联合Fe3O4纳米粒及静磁场的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的新型外泌体能够通过上调miR-1206a显著促进成骨和新生血管形成。此外，Filippi等[34]将MNPs掺入到聚乙二醇水凝胶中，在静磁场刺激下，促进血管相关基因的表达、骨修复及新生血管形成。此外，有研究提出细胞片技术在多重因素的影响下对血管生成具有正向作用。Silva等[35]利用Fe3O4纳米粒、人脐静脉内皮细胞及脂肪干细胞共同构建磁响应细胞膜片，促进3D细胞结构的成骨及新生血管形成。磁响应纳米材料可从本身的理化性质、与微量元素的结合、细胞因子的负载机仿生人工骨膜等方面促进新生血管形成，同时，由于磁响应特性，使细胞产生的机械形变对血管生成产生正向作用，使磁响应材料在临床应用有较好的前景。

4.8磁响应纳米材料促进骨修复 目前组织工程存在的问题主要是细胞大多数在于材料的表面，很难进入支架中心。近年来，有观点提出利用外部磁场促进细胞迁移至三维支架的中心。Li等[36]研究Fe3O4/聚多巴胺复合纳米粒，促进细胞因子及相关蛋白表达，在没有电磁场作用下能促进间充质干细胞迁移。Xia等[37]将氧化铁纳米粒加入到磷酸钙骨水泥中，观察Wnt/β-catenin的激活，显著促进牙髓干细胞的黏附、成骨分化和矿物合成。随着对生物支架材料结构的研究，为了避免细胞利用率低的问题，有研究提出基于无支架细胞膜片的技术，能保留丰富的细胞外基质，避免细胞丢失，提高细胞利用率，形成良好的三维结构。细胞膜片的制备技术丰富，由于MNPs具有良好的分离能力及超顺磁性，通过MNPs制备多细胞膜片对骨组织工程中生物支架材料的研发提供了新的思路。Santos等[38]首次使用MNPs标记的MC3T3-E1和脂肪干细胞在磁力作用下制备分层无支架的异型磁响应细胞膜片，使用MNPs标记的脂肪干细胞制备同型磁响应细胞膜片，发现21 d后在无成骨诱导因子的作用时也能具有较高的成骨基因水平和体外矿化能力，且异型高于同型磁响应细胞膜片。磁响应纳米材料的生物安全性及促进组织修复的实验时间脉络见表1。

表1 磁响应纳米材料的生物安全性及促进组织修复的实验时间脉络表

5 结语

目前关于磁响应纳米材料与电磁场在骨组织工程中的研究众多，但仍未找到最优解决方案。磁响应纳米材料的制备与结构决定了最终材料的性能及应用。理想的生物材料需要良好的体内降解性能，现阶段只能通过制备时预先设定，无法根据骨愈合的实际情况决定降解速率，影响骨修复。近年来在体内实验部分多数以鼠类为主，所得的数据对于磁响应纳米材料应用于大型动物或者人体的参考价值不足，需要放大数倍才能感应，可能伴随出现更多的安全性问题，仍需要更长时间监测，同时缺少电磁场及磁响应纳米材料在体内的远期研究。如何优化其制备，调控其降解，实现在体内的应用及远期监测，这也是未来众多学者需探索的问题。如今电磁场与磁响应纳米材料在骨组织工程中研究增多，潜在机制尚不明确，需进一步研究和探讨。磁响应纳米材料更多应用于创伤、肿瘤、骨感染、骨膜剥离等原因造成的严重的骨缺损或骨折不愈合。除此之外，还可用于肿瘤的诊断、监测及治疗。通过直接注射或者静脉注射将MNPs植入肿瘤部位，利用磁性产热，导致细胞凋亡。目前磁响应纳米材料仍然处于研究当中，尚未发现用于临床。但是磁响应纳米材料的独特性质加速了其在骨组织工程中的应用，为临界尺寸的骨缺损修复提供了新的思路。