鸡IL-2和IL-4融合基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

徐 彤 ， 贡 鑫 ， 郑明学 ， 吕晓玲 ， 郑龙龙 ， 崔凯玲 ， 张雪松 ， 段步婷 ， 白 瑞

(山西农业大学动物医学学院 ， 山西 太谷 030801)

鸡球虫病是一种危害性较大的肠道寄生虫病[1]，每年给养殖业带来巨大损失。目前，对鸡球虫病防治的手段主要是化学药物和活疫苗，而药物防治存在药物残留、免疫抑制和耐药性问题，活疫苗的免疫产生期长且影响雏鸡增重。因此，高效免疫预防鸡球虫病成为一个热门研究课题。随着生物技术的不断发展，融合细胞因子作为一种新的疫苗免疫佐剂成为可能[2]。白介素2(Interleukin 2，IL-2)在免疫系统中具有上调免疫应答的作用，使得免疫产生时间缩短。白介素4(Interleukin 4，IL-4)能够增强单核细胞的抗原递呈能力从而缩短抗体产生时间[3]。许多研究发现，表达2种不同细胞因子的融合蛋白具有免疫佐剂的作用。目前国内外尚无IL-2和IL-4融合基因佐剂。因此本试验构建鸡IL-2(Chicken interleukin 2,chIL-2)和鸡IL-4 (Chicken interleukin 4,chIL-4)融合基因真核表达质粒，以期为研究新型细胞因子免疫佐剂夯实基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及动物 大肠杆菌DH5α和pCI质粒，均为本实验室保存；pEGFP-N3质粒，购自上海瓦兰生物科技有限公司；15日龄SPF鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.2 主要试剂 QuickCutTMEcoR I、QuickCutTMSalI、QuickCutTMKpnI、QuickCutTMNotI、DNA Ligation Kit、PrimeScriptTMRT Reagent Kit和SYBR®PremixExTaqTMGC，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；SanPrep无内毒素质粒DNA小量抽提试剂盒和柱式DNA胶回收试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；MTT试剂盒，购自上海索莱宝生物科技有限公司；HilyMax，购自上海同仁化学研究所。

1.3 试验方法

1.3.1chIL-4与chIL-2基因合成 根据GenBank中chIL-4(453 bp)基因序列(AJ621249.1)加EcoR I和KpnI酶切位点，下游去终止密码子TGA并加Linker序列；根据GenBank中chIL-2基因(429 bp)序列(AF000631.1)，加KpnI和SalI酶切位点，去终止密码子TAA。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组克隆质粒pUC57-ChIL-4和pUC57-ChIL-2。

1.3.2 重组克隆质粒和真核表达质粒的双酶切、回收与鉴定 按QuickCutEcoR I和QuickCutKpnI说明书，将pUC57-ChIL-4重组质粒和pCI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收pCI(约4 000 bp) 和ChIL-4的目的条带；同样方法双酶切与鉴定pUC57-ChIL-2和pCI，胶回收pCI与ChIL-2的目的条带。

1.3.3 连接与转化 按DNA Ligation Kit说明书进行连接反应，双酶切后的pCI分别与IL-4和IL-2片段按摩尔比3∶1混合为10 μL体系；加等体积Ligation Mix混匀，16 ℃ 30 min；转化并增菌培养；按SanPrep无内毒素质粒DNA小量抽提试剂盒说明书提取质粒pCI-chIL-4和pCI-chIL-2。

1.3.4chIL-2连接至pCI-chIL-4质粒 按QuickCutKpnI和QuickCutSalI说明书双酶切pCI-chIL-4，琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收约4 459 bp目的条带；pCI-chIL-4与chIL-2基因片段连接与转化同1.3.3项，获得pCI-chIL-4-chIL-2重组质粒。

1.3.5 pCI-chIL-2、pCI-chIL-4、pCI-chIL-4-chIL-2质粒上连接增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因 按QuickCutKpnI和QuickCutNotI说明书双酶切pCI-chIL-4和pEGFP-N3，琼脂糖凝胶电泳鉴定；同样方法双酶切、鉴定及胶回收pCI-chIL-2、pCI-chIL-4-chIL-2、pEGFP-N3；pCI-chIL-4-chIL-2、pCI-chIL-4、pCI-chIL-2分别与EGFP基因连接、转化并提取质粒DNA，方法同1.3.3项。将构建的质粒送至深圳华大基因公司测序。

1.3.6 细胞转染与真核细胞表达 将原代鸡胚盲肠上皮细胞以3×105个/mL接种于24孔板中，41 ℃、 8% CO2培养箱培养；贴壁率达80%～90%时，将细胞分为5个组：空白组(A0，不加pCI、Opti-MEM培养基、HilyMax)、空载组(A1)、pCI-chIL-2-EGFP组(A2)、pCI-chIL-4-EGFP组(A3)和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP组(A4)，每组16个孔。其中A1～ A4组分别添加相应质粒 16 μg、Opti-MEM培养基480 μL、HilyMax 48 μL，孵育4 h；在24、48、72 h和96 h检测转染率、转染细胞chIL-4、chIL-2基因mRNA表达量、细胞内蛋白表达量和细胞培养液中融合蛋白表达量。

(1)转染率：荧光细胞数占活细胞总数的百分比。

(2)chIL-4、chIL-2基因mRNA表达量测定:按SYBR®PremixExTaqTMGC说明书进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，用Primer 3软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：鸡IL-4(156 bp)：F 5′-AGCCAGCACTGCCACAAGAAC-3′, R 5′-GTGGAAGAAGGTACGTAGGTC TGC-3′；鸡IL-2(155 bp)：F 5′-AGTGCACCCAGCAAACTCTG-3′, R 5′-TCCGGTGTGATTTAGACCC GT-3′；鸡β-actin(135 bp)：F 5′-CACCACAGCCGAGAGAGAAAT-3′, R 5′-TGACCATCAGGGAGTTCATAGC-3′。反应体系：SYBR®PremixExTaqII(Tli RNaseH)(2×) 10 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.4 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.4 μL、ROX Reference Dye II(50×) 0.4 μL、cDNA溶液(Template) 2 μL、ddH2O 6.8 μL,共20 μL；反应程序：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,40个 循环。鸡β-actin基因为内参，RT-qPCR结果用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。

(3)细胞内蛋白表达量：采用Image-Pro Plus. v 6.0软件测量荧光细胞累积光密度(IOD)。

(4)细胞培养液中融合蛋白表达量：按芮琴[4]的方法用荧光分光光度计(激发波长、发射波长分别为460 nm、509 nm)测定各时间段细胞上清的荧光强度。

1.3.7 表达产物的生物学活性鉴定 按范忠玲[5]的方法测定表达产物对淋巴细胞增殖活性的影响。取37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h的鸡脾淋巴细胞悬液，接种于96孔板中，细胞密度为5×103个/μL，50 μL/孔。试验分为6个组(每组5个孔)，分别为空白组(C，无细胞仅含RPMI 1640培养基的对照)、细胞阴性对照组(C0)、试验组(B1～B4)。分组后，B1～B4组再分别添加1.3.6项A1～A4组转染后各时间段细胞上清液50 μL/孔，空白组(C)和细胞阴性对照组(C0)加DMEM培养基50 μL/孔，继续培养36 h。MTT法检测各组细胞活性，计算刺激指数(SI)。

2 结果

2.1 pUC57-chIL-4和pUC57-chIL-2重组质粒鉴定 pUC57-chIL-4重组质粒双酶切得到约453 bp和2 700 bp 的条带，pUC57-chIL-2重组质粒双酶切得到约429 bp和2 700 bp的条带，与预期一致，见图1。

图1 pUC57-chIL-4和pUC57-chIL-2双酶切电泳图

2.2 pCI-chIL-4、pCI-chIL-2和pCI-chIL-4-chIL-2重组质粒鉴定 重组质粒pCI-chIL-4可酶切得到约453 bp 和4 000 bp的条带，pCI-chIL-2可酶切得到约429 bp 和4 000 bp的条带，重组质粒pCI-chIL-4-chIL-2可酶切得到约4 000 bp和888 bp的条带，符合预期结果(图2)。

图2 pCI-chIL-4-chIL-2、pCI-chIL-2和pCI-chIL-4双酶切电泳图

2.3 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组质粒鉴定 重组质粒pCI-chIL-4-EGFP可酶切得到约770 bp和4 400 bp的条带，重组质粒pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可酶切得到约770 bp和4 900 bp的条带，重组质粒pCI-chIL-2-EGFP可酶切得到约770 bp和4 400 bp的条带，初步证实质粒构建成功(图3)。

图3 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP双酶切电泳图

测序结果用NCBI BLAST与GenBank中发表的EGFP、chIL-2、chIL-4基因序列进行比对，发现基因序列匹配度100%，符合预期结果。

2.4 鸡胚盲肠上皮细胞转染效果及表达效果

2.4.1 转染效果 转染重组质粒pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP后24～96 h，转染率先升后降，48 h达峰值，96 h为0，且各时间段间差异不显著(P>0.05)。pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP规律同pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP，见图4和图5。

图4 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP在鸡胚盲肠上皮细胞中的转染效果

图5 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP转染鸡胚盲肠上皮细胞

2.4.2 表达效果

2.4.2.1ChIL-4、ChIL-2基因mRNA表达量测定 转染后24～96 h，chIL-4-chIL-2、chIL-2和chIL-4基因的mRNA表达量均先升高后降低，48 h时极显著高于其他时间段(P<0.01)，见图6。

图6 目的基因mRNA的相对表达量

2.4.2.2 细胞内蛋白表达量 重组质粒pCI-chIL-2-EGFP转染后24～96 h，细胞累积光密度(IOD)值先升后降，72 h达峰值，其IOD值显著高于48 h(P<0.05)或极显著高于24 h(P<0.01)，96 h为0。pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP变化规律同pCI-chIL-2-EGFP。空载组各时间段均为0，见图7。

图7 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP在鸡胚盲肠上皮细胞中的表达

2.4.2.3 细胞培养液中融合蛋白表达量 重组质粒pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP转染后24～96 h，荧光强度先升后降，72 h达峰值且极显著高于其他时间段(P<0.01)。 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP变化规律同pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP，见图8。

图8 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP转染细胞后表达蛋白的分泌情况

2.5 真核重组质粒表达产物的生物学活性鉴定 转染后24～96 h，B2、B3组和B4组的表达产物对淋巴细胞增殖活性的影响均先升后降，且均极显著高于B1组(P<0.01)，B4组极显著高于B2组和B3组(P<0.01)，B2组和B3组无差异(P>0.05)，见图9。

图9 各组表达产物对淋巴细胞增殖活性的影响

3 讨论

本试验用DNA重组技术将IL-4和IL-2基因与EGFP基因融合构建重组质粒，经凝胶电泳、基因测序、转染细胞内和细胞培养液荧光蛋白测定，表明成功构建了3种真核表达质粒，且转染鸡胚盲肠上皮细胞后可持续表达并分泌chIL-2、chIL-4、chIL-4-chIL-2融合蛋白，为进一步研究提供基础。

研究发现，IL-2和IL-4都可促进淋巴细胞增殖[6-7]。鸡脾淋巴细胞增殖活性试验结果显示，转染于原代鸡胚盲肠上皮细胞后分泌的chIL-2、chIL-4蛋白和chIL-4-chIL-2融合蛋白在各时间段均能促鸡脾淋巴细胞增殖。戴华等[7]通过试验获得的重组蛋白pBac-ChIL-4能刺激鸡脾淋巴细胞增殖。牛泽[8]研究结果表明，重组ChIL-2蛋白对鸡脾淋巴细胞有显著增殖作用。以上研究结果与本试验结果一致。本试验发现，3种重组质粒对鸡脾淋巴细胞增殖均有显著促进作用，而单一chIL-2、chIL-4促进鸡脾淋巴细胞增殖作用显著低于chIL-4-chIL-2，结果表明chIL-4-chIL-2融合蛋白具有更好的生物学活性。闫若潜等[9]以鸡α干扰素与IL-2为对象构建融合基因并获得其重组融合蛋白，结果表明此蛋白有双重生物学活性。马文涛[10]以猪IL-2和IL-6基因为对象获得重组融合蛋白，通过试验证实此蛋白生物学活性优于单一重组蛋白。上述研究结果与本试验结果相同。但是chIL-4-chIL-2细胞因子免疫佐剂能否缩短免疫产生期还需进一步的验证。总之，3种重组质粒对鸡脾淋巴细胞的增殖均有促进作用，且融合蛋白chIL-4-chIL-2的生物学活性明显优于单一蛋白。