基于整合药理学预测二至丸治疗高血压的分子机制

李梓源，罗植允，冯晶晶，吴 伟

高血压是以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高[收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒张压≥90 mmHg]为主要特征的心血管疾病，亦是心血管疾病中患病率较高的慢性疾病。长期高血压将对人体心、脑、肾、血管等靶器官造成严重功能损害。我国高血压具有患病率高及知晓率、治疗率、控制率低特点[1]， 说明多数高血压病人对身体健康状况不甚了解或难以对病情进行控制或治疗。目前临床治疗高血压以西药为主，西药虽有较好的临床疗效，便于携带，方便服用，但长期服用降压药易产生耐药性，且西药有一定的副作用。中药温和，对肝肾毒副作用较小，亦有较好的临床疗效，因此，中药对长期治疗并维持血压的稳定具有较大优势。二至丸出自清代的《医方集解》，方中含有女贞子和墨旱莲，作为平补肝肾之剂，具有补养肝肾、滋阴补血的功效，对肝肾阴虚证型高血压具有较好的治疗作用，目前二至丸治疗高血压的作用机制尚未明确。本研究基于网络药理学，探讨二至丸治疗高血压的作用机制，深入研究二至丸中药物与治疗肝肾阴虚型高血压的关系，为二至丸的临床应用提供准确的参考依据。

1 资料与方法

1.1 二至丸有效成分及相关靶点筛选 分别以“女贞子”“墨旱莲”为关键词检索TCMSP中草药药理学平台，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为标准，获取二至丸中女贞子、墨旱莲的有效成分及相关靶点，应用UniProt数据库进行gene symbol转换，物种设置为“Homo sapiens”。

1.2 高血压基因的获取 基于GeneCards数据库，分别以“hypertension”“high blood pressure”为检索词，获得排名居前2 000位的基因，取并集获得高血压基因。

1.3 蛋白-蛋白互作(PPI)网络图的构建 将二至丸的相关靶点与高血压基因取交集，获得二至丸治疗高血压的核心靶点，再将核心靶点导入STRING数据库，构建PPI网络图。

1.4 京都基因与基因组百科全书(KEGG)与基因本体(GO)功能富集分析 将核心靶点导入DAVID数据库，物种设置为“Homo sapiens”，分别进行KEGG通路富集分析与GO功能富集分析，GO分析涉及分子功能、生物过程、细胞组成，以P<0.05为筛选标准，获取KEGG通路和GO功能富集分析结果。

1.5 可视化分析 分别通过OmicShare数据平台(www.omicshare.com/tools/)绘制Venn图，应用Cytoscape 3.7.2软件绘制网络图并进行数据分析。

2 结 果

2.1 二至丸的活性成分及相关靶点 通过TCMSP数据库，分别检索出女贞子119个有效成分，墨旱莲48个有效成分。以OB≥30%、DL≥0.18为标准，最终得到女贞子活性成分13个、墨旱莲活性成分10个，详见表1。其中槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)为二者共有成分，可能为二至丸治疗高血压的关键成分。分别检索女贞子、墨旱莲的活性成分靶点，共获得182个、127个相关靶点。

表1 二至丸活性成分

2.2 高血压基因的获取及核心靶点预测 基于GeneCards平台，分别检索“hypertension”“high blood pressure”，取并集后共获得2 637个基因。将其与二至丸相关靶点取交集，共获得143个核心基因。详见图1。

图1 二至丸及高血压基因的Venn图

2.3 PPI网络图及关键靶点预测 将143个核心基因导入STRING数据库，建立PPI网络图，下载数据后导入Cytoscape 3.7.2软件。通过Network Analyzer模块进行网络分析，以Degree值为标准进行排序，最终得到10个关键靶点，分别是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素-6(IL6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、胱天蛋白酶3(CASP3)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子受体(EGFR)、肉瘤病毒17癌基因(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮细胞生长因子(EGF)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、MYC基因(MYC)。详见图2。

图2 核心靶点网络图

2.4 KEGG与GO富集分析 基于DAVID数据库富集分析，共获得二至丸治疗高血压的20条KEGG关键通路，主要涉及肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、缺氧诱导因子1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)等，详见图3。GO分析得到15条关键生物途径，主要涉及酶结合(enzyme binding)、相同蛋白结合(identical protein binding)、药物反应(response to drug)、凋亡过程负调控(negative regulation of apoptotic process)、细胞外间隙(extracellular space)等，详见图4。

图3 核心通路富集图

图4 生物途径GO分析(黄色代表分子功能；绿色代表生物过程；蓝色代表细胞组成)

3 讨 论

氧化应激与高血压的发生发展密切相关，体内活性氧生成过多，血管平滑肌细胞发生氧化损伤，导致血管炎症，血压升高。目前，几乎所有人体研究均表明槲皮素可降低高血压病人血压，其机制可能与降低氧化应激[2]，干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)[3]和改善血管内皮功能[4]等有关。

木犀草素是一种常见的黄酮类化合物，可上调超氧化物歧化酶(SOD)表达，并减少氧化损伤介质丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)等抑制氧化应激[5]；并激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/一氧化氮(PI3K/AKT/NO)信号通路，使内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化增加，增加内皮型一氧化氮合成与释放，从而发挥舒张血管的作用[6]。木犀草素通过抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，改善高血压相关血管重塑[7]。AKT1是蛋白激酶B(AKT)的亚型之一。有研究显示，NO生成减少导致内皮依赖性血管舒张功能受损是高血压发生发展的机制之一，由于许多内皮细胞信号转导途径聚集在AKT上，导致eNOS磷酸化和活化，因此该分子可作为增加eNOS反应的理想靶点[8]。IL-6、TNF等炎性因子可促进心肌成纤维细胞分化和胶原生成增加，是构成高血压心肌纤维化的病理生理基础[9]。VEGFA结合VEGFR后，通过PI3K/AKT信号通路增加eNOS磷酸化及其活性，使NO产生增加，血管通透性和内皮细胞存活，并介导内皮依赖性血管舒张[10]。Caspase-3是细胞凋亡过程中主要的终末剪切酶[11]，其介导的细胞凋亡参与高血压病理生理的多个过程[12]。

TNF信号通路具有多种生物学效应，TNF-α过表达可损伤血管内皮，促进血管平滑肌细胞迁移和增殖，使血管内膜增生，外周阻力增加。TNF-α可促进血管炎症反应，并诱导IL-6表达，促进血管内皮损伤，血管收缩，血压升高[13]。HIF-1α和HIF-2α表达之间的平衡是维持正常组织灌注和全身动脉压的重要因素[14]。可见，HIF-1信号通路与血压关系密切。PI3K/AKT信号通路是调节细胞增殖、血管生成和凋亡的重要途径，参与机体抗氧化过程，与左室肥大和血管舒张功能障碍有关[15]。VEGF信号通路对血管生成及维持正常的血管内皮功能具有重要的意义。高血压长期压力负荷产生的机械牵张刺激使MAPK信号通路过度激活，引起心肌细胞肥大、心肌肥厚，导致高血压性心脏病发生[16]。肾素-血管紧张素系统(RAS)激活是血压调控的重要机制，RAS系统中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)具有较强的缩血管作用，通过刺激肾上腺皮质球状带，促进醛固酮分泌，水钠潴留增加，血压升高[17]；AngⅡ可增加交感神经递质和特异性受体的活性，使血压升高[18]；AngⅡ可反馈性地抑制肾素分泌并刺激肾脏分泌前列腺素，调节血压水平[19]。心肌和平滑肌收缩取决于细胞内有力钙离子浓度，细胞外钙离子内流增加或肌浆网钙释放增加，均导致细胞内钙离子浓度增加，使血管平滑肌收缩增强，血压升高。

总之，二至丸具有多靶点、多通路治疗高血压的特点，二至丸降压治疗的药效成分、作用靶点、分子通路可为进一步深入揭示其作用机制奠定了基础。