高寒退化草甸优势种大狼毒对三种受体植物的化感作用

王紫媛，刘星月，周松林，李 伟

（西南林业大学 地理与生态旅游学院，云南 昆明 650000）

【研究意义】滇西北位于青藏高原东南部、横断山区的核心地带，属于我国“两屏三带”绿色发展生态安全屏障中的“川滇生态屏障”区域，植物多样性非常丰富[1]。以滇西北迪庆州为例，其境内广泛分布着高寒草甸生态系统，发挥着涵养水源、保持水土、维持生物多样性等关键生态系统功能[2]，对区域生态环境可持续发展而言具有十分重要的意义。然而，近年来由于过度放牧及无序观光旅游等问题，导致滇西北大面积的高山草甸生态系统发生退化，毒害草蔓延趋势日益严重[3]。滇西北“毒害草”主要包括大狼毒（Euphorbia jolkinii）、大黄橐吾（Ligularia duciformis）和舟叶橐吾（Ligularia cymbulifera）等，其中大狼毒分布最广，因而也成为滇西北高寒草甸退化的一种重要指示性植物[5-6]。【前人研究进展】大狼毒为大戟科大戟属多年生草本植物，由于其自身具有毒性，往往不被家畜食用。近年来，其种群在滇西北高寒草甸迅速扩张，尤其在过度放牧的退化草甸区域常取代本土优良牧草而成为优势物种[6-8]，从而改变了生态系统原有植物结构，减少了草甸原生植物的多样性，给高寒草甸生态系统的可持续发展及当地畜牧业发展带来严重威胁[6,9]。【本研究切入点】大狼毒可能通过植物的化感作用来抑制本土植物的生长与发育，从而成为造成滇西北高寒草甸退化的一个主要重要原因。化感作用是指植物通过向环境中释放化学物质，从而对其周围生物所产生的直接或间接的抑制或促进作用[10-11]，该作用主要来源于植株根系分泌、凋落物的淋溶和腐解等[12]。【拟解决的关键问题】在滇西北退化高寒草甸生态系统中，大狼毒是否对本土植物的生长与发育具有显著的化感作用？目前，针对此问题的研究较为缺乏。因此，本文采用野外考察与室内试验相结合的方法，探究大狼毒对区域植物多样性的影响，以及利用取自不同部位、具有不同浓度的大狼毒浸取液对3 种本土牧草植物（紫云英、黑麦草和早熟禾）种子萌发和幼苗生长的影响，探究大狼毒在滇西北高寒草甸退化中的作用，为滇西北高寒草甸的退化防治与生态环境保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 野外调查

1.1.1 调查地概况 香格里拉市位于滇西北迪庆藏族自治州东部（图1），属青藏高原南缘横断山脉的腹地，纬度位置为26°52′～28°52′N，99°20′～100°29′E。地势西北高东南低，平均海拔3 500 m，年平均气温6.4 ℃，年降水量649.4 mm，年日照数2 141 h，无霜期共164 d。香格里拉高寒退化草甸区域主要生活着以菊科、蓼科、玄参科、蔷薇科、毛茛科为代表的草本植物。在本研究中，草甸植被调查及试验材料取样工作均在香格里拉市蓝月山谷区域开展。蓝月山谷位于香格里拉市西南部，距市中心7 km，占地约60 km2，区域内有较大规模的大狼毒种群聚集。

图1 研究区位置及样点分布Fig.1 Location and sample distribution of the study area

1.1.2 植物多样性调查 在蓝月山谷大狼毒生长范围（半径30 m范围内有大狼毒植株生长）和无大狼毒生长范围内（直径范围30 m 内无大狼毒植株生长）各随机选取10 块10 m×10 m 的样地（图1），设置大小为1 m×1 m的样方，调查并记录样方内各草甸植物的种类、高度、数量、盖度、冠幅等信息。通过计算各样地内的草甸植物多样性指数，分析比较有无大狼毒生长的两个区域间草甸植物多样性的差异，从而探究大狼毒的化感作用对高寒草甸生态系统的影响。

1.2 研究材料

1.2.1 浸取液制备 在蓝月山谷大狼毒群落聚集区域采集供试植物大狼毒样品，采集时间为2017 年8月和2018 年8 月。采集时选取中等大小、生长良好的大狼毒植株。采集当天对所收集的大狼毒植株进行清洗，按根、茎、叶的部位进行归类并剪为约2 cm 长的小段。分别称取剪碎后的大狼毒根、茎、叶各200 g 并置于洁净的塑料瓶中，然后各加入800 mL 蒸馏水并浸泡48 h，且每隔6 h 摇晃5 min。用纱布和滤纸过滤浸取液，得到大狼毒根、茎、叶水浸液并置于4 ℃的冰箱中保存备用[13-14]。

1.2.2 受试材料 受试材料为紫云英、黑麦草和早熟禾的种子，均采自蓝月山谷。3 种受试种子的植物学特征如表1所示。

表1 3种受试牧草种子Tab.1 Three tested forage seeds

1.3 种子萌发及幼苗生长试验

挑选颗粒饱满且无虫害的黑麦草、早熟禾和紫云英种子各20 粒，用0.1%浓度的高锰酸钾（KMnO4）溶液浸泡10 min消毒，用蒸馏水清洗干净后，以蒸馏水浸泡3 h催芽。在培养皿中铺上2层定性滤纸，干热灭菌2 h。将3种植物种子铺到灭菌后的培养皿上，每皿20粒种子，共设2组重复。大狼毒根、茎、叶3个组织部位的浸取液稀释为1/2、1/4、1/6 浓度后（即浓度梯度为：0.2，0.1，0.05，0.033 g/mL），以每皿5 mL 滴加到培养皿中，并用塑封袋套封培养皿，以免溶液挥发。培养皿置于实验室培养待种子发芽，实验室日光照时长＞12 h，室内温度25 ℃左右，培养7 d 后每天记录种子发芽数，发芽试验以种子连续3 周不再萌发的时间为末次计数时间，计算发芽率，并进行方差分析。

种子萌发7 d 左右选取发芽水平相近的幼苗移栽进装填好土壤基质的穴盘，每穴一株幼苗，一个处理重复6株幼苗。移栽时测量株高和统计幼苗叶片数[15]。以稀释过后的大狼毒根、茎、叶浸取液（浓度梯度为：0.1，0.05，0.033 g/mL）滴浇幼苗，每穴5 mL，每周补浇一次。一个月后用游标卡尺测量幼苗株高，统计幼苗叶片数。计算每组处理幼苗高度、叶片数平均值，对统计结果做方差分析。

1.4 数据处理

1.4.1 多样性指数

式 （1）、（2）和（3）中，S为物种数目；Pi为第i个物种所占的比例。

1.4.2 化感作用

式（4）中，M1为最终正常发芽种子粒数；M为种子总粒数。

参照Williamson 等[17]的方法计算化感作用效应指数（allelopathic response index，RI）来衡量大狼毒对3种受试植物种子发芽与幼苗生长的影响程度。公式如下：

式（5）中：C为对照值；T为处理值。RI＜0为抑制效应，RI＞0为促进效应。RI的绝对值大小表示化感作用的强弱[16]。

采用Excel 2019进行数据统计，利用SPSS 25.0对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan’法进行多重比较（α=0.05），并利用R软件作图。试验数据均用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 大狼毒对群落植物多样性的影响

根据野外调查数据可知，在大狼毒群落区，大狼毒平均盖度为85%～90%，其余物种盖度均较低，例如小苦苣、椭叶花锚、西南委陵菜、蒿草等物种在大狼毒群落区并未有分布，而在非大狼毒群落区均有较广泛分布。此外，在非大狼毒群落区，小画眉草平均盖度为30%～50%，早熟禾平均盖度为15%～20%，云南高山豆平均盖度为10%～30%，然而这3种植物在大狼毒群落区平均盖度均小于10%。这与尹海燕等[6]的研究结果契合。

通过计算多样性指数（表2），比较大狼毒群落区和非大狼毒群落区的多样性指数。由图2 可得：大狼毒群落区物种丰富度、Simpson 指数和Shannon-Wiener 指数均显著低于非大狼毒群落区。具体来看，非大狼毒群落区平均丰富度、Simpson 指数和Shannon-Wiener 指数分别为14、0.832 5 和2.075 5，大狼毒群落区3种指数分别为9.8、0.532 2和1.265 4。

表2 大狼毒群落区和非大狼毒群落区物种多样性指数Tab.2 Species diversity index of Euphorbia jolkinii community and non Euphorbia jolkinii community

在方差分析结果（图2）中，Shannon-Wiener指数：F1,18=242.7，P＜0.001；Simpson指数：F1,18=312.7，P＜0.001。这表明，大狼毒群落区与非大狼毒群落区的物种丰富度、Simpson 指数和Shannon-Wiener 指数均具有显著差异。因此，大狼毒对其周围的植物生存具有明显的抑制作用，从而降低群落的植物多样性。

图2 大狼毒群落区和非大狼毒群落区物种多样性指数Fig.2 Species diversity index of Euphorbia jolkinii community and non Euphorbia jolkinii community

2.2 大狼毒浸取液对3种作物种子萌发的影响

从图3、表3 可知，0.2 g/mL 浓度的大狼毒根浸取液（R1）处理过的紫云英种子发芽率为0，明显低于对照组，且与茎、叶浸取液相比，其RI 指数绝对值最高，为-1，表明该浓度的大狼毒根浸取液对紫云英种子发芽的抑制作用最强。而随着根浸取液浓度降低，这种抑制作用逐渐消失，RI 值由负转为正。大狼毒根浸取液的浓度与紫云英种子发芽率呈负相关，其对紫云英种子发芽具有显著的抑制作用（P=0.001 56＜0.01）。而大狼毒根、茎、叶浸取液处理的紫云英种子发芽率与对照组相比差异不大，其中仅S1/2（0.1 g/mL 浓度的茎浸取液）和L1/2、L1/4（0.1 g/mL、0.05 g/mL 浓度的叶浸取液）对紫云英发芽率存在一定抑制效果，相较于对照组，发芽率分别降低了10.71%、14.29%和10.71%。方差结果显示，大狼毒茎、叶浸取液对紫云英种子发芽无显著影响（P＞0.05）。

表3 不同浸取液对紫云英、黑麦草和早熟禾种子发芽率的影响Tab.3 Effects of different extracts on seed germination rate of Astragalus sinicus，Lolium perenne，and Poa annua

图3 大狼毒浸取液对紫云英、黑麦草和早熟禾种子发芽率的影响Fig.3 Effects of Euphorbia jolkinii extract on seed germination rate of Astragalus sinicus，Lolium perenne，and Poa annua

0.2 g/mL浓度的大狼毒根浸取液（R1）处理的黑麦草种子发芽率最低，为0，其RI指数为-1，这说明该浓度的根浸取液对黑麦草种子发芽率的抑制作用最强。其次，R1/2（0.1 g/mL浓度的根浸取液）对黑麦草种子发芽率影响的RI指数为-0.09，相较对照组其发芽率降低了8.82%。这表明大狼毒根浸取液对黑麦草种子发芽具有显著抑制作用（P＜0.001）。大狼毒茎、叶浸取液处理的黑麦草种子发芽率相较于对照组，没有明显差异，其中茎浸取液除S1/2（0.1 g/mL浓度的茎浸取液）外，其处理的黑麦草种子发芽率均与对照组相同，RI 指数为0。叶浸取液除L1（0.2 g/mL 浓度的叶浸取液）处理的发芽率为0 外，其他浓度的发芽率均有所减少，但其RI指数均较低，抑制作用不明显，这说明大狼毒茎、叶浸取液对黑麦草种子发芽无显著作用（P＞0.05）。

总体来说大狼毒3 个部位不同浓度梯度的浸取液对早熟禾种子发芽率均存在不同程度的抑制作用，RI 指数均为负，不同浓度梯度的大狼毒茎浸取液处理过的早熟禾种子发芽率与对照组的差异较小，而根、叶浸取液与对照组的差异较大。其中R1（0.2 g/mL 浓度的根浸取液）的抑制效果仍最明显，RI值为-1，各浓度梯度的叶汲取液对发芽率的抑制效果均较明显。方差分析结果显示，大狼毒根、叶浸取液对早熟禾种子发芽存在显著的抑制作用（P根＜0.001，P叶＜0.05），而茎浸取液对早熟禾种子发芽无显著影响（P＞0.05）。

综上所述，大狼毒浸取液对3 种植物种子发芽均具有统计学意义上的显著抑制作用，这说明大狼毒对3种牧草植物存在化感效应，从而抑制植物种子的萌发。具体而言，在大狼毒各部位浸取液中，根浸取液对植物种子萌发的抑制性最为明显，尤其是浓度梯度为最高时，这种作用尤为突出。

2.3 大狼毒浸取液对3种作物幼苗生长的影响

由图4、表4 可知，各浓度梯度的大狼毒根、茎、叶浸取液处理的幼苗高度均低于对照组，但差异较小，仅L1/2（0.1 g/mL 浓度的叶浸取液）处理的紫云英幼苗高度明显比对照组低1.98 cm，其RI 指数为-0.28。各处理RI 指数绝对值均为负，表明浸取液对紫云英幼苗生长存在较小的抑制效果[19-20]。方差分析显示，大狼毒根、茎、叶浸取液对紫云英幼苗生长均没有显著影响（P＞0.05）。

表4 不同浸取液对紫云英、黑麦芽和早熟禾幼苗芽高的影响Tab.4 Effects of different extracts on bud height of young seedlings of Astragalus sinicus，Lolium perenne，and Poa annua

图4 大狼毒浸取液对紫云英、黑麦芽和早熟禾幼苗芽高的影响Fig.4 Effects of extract of Euphorbia jolkinii on bud height of young seedlings of Astragalus sinicus，Lolium perenne，and Poa annua

在试验中，各浓度下的大狼毒根、茎、叶浸取液处理的黑麦草幼苗高度均低于对照组，但差异不大。其RI指数均低于0，表明大狼毒浸取液对黑麦草幼苗高度存在一定的抑制性。但方差分析显示，大狼毒各部位浸取液对黑麦草幼苗生长均不存在显著作用（P＞0.05）。

除R1/2（0.2 g/mL浓度的根浸取液）和S1/6（0.033 g/mL浓度的茎浸取液）处理的早熟禾幼苗高度略高于对照组外，其他浸取液处理的幼苗高度均低于对照组，RI指数均为负。说明大狼毒浸取液对早熟禾幼苗芽高具有轻微的抑制作用。然而方差分析表明，大狼毒浸取液对早熟禾幼苗生长无显著抑制作用（P＞0.05）。

综上所述，大狼毒浸取液似乎对3种植物具有一定的抑制性，但均不存在统计学意义上的显著作用。因此，无法判断大狼毒对其他植物生长是否存在化感作用带来的抑制效果。

3 结论与讨论

3.1 结论

3.1.1 大狼毒对退化高寒草甸植物多样性的影响 在滇西北高寒退化草甸上，大狼毒群落区物种丰富度、Simpson 指数和Shannon-Wiener 指数明显低于非大狼毒群落区，其他植物在大狼毒群落区的分布明显比非大狼毒聚集区少，平均盖度明显更低。大狼毒对高寒退化草甸的植物多样性存在显著的负面影响，这可能与大狼毒的化感作用有关。

3.1.2 大狼毒浸取液对受试植物种子萌发的影响 试验结果及方差分析显示，大狼毒浸取液对紫云英、黑麦芽和早熟禾3种牧草植物种子萌发具有化感作用。具体而言，大狼毒根浸取液对紫云英、黑麦芽及早熟禾的种子发芽率均具有显著的抑制作用，叶浸取液对早熟禾种子发芽率具有显著抑制作用，而茎浸取液对3种植物的种子发芽率均不存在显著的抑制效果。其中，浓度为0.2 g/mL的根浸取液（R1）对种子萌发的化感效应最强烈。

3.1.3 大狼毒浸取液对受试植物幼苗生长的影响 在此次大狼毒浸取液对植物幼苗芽高影响的试验中，不同梯度下的大狼毒根、茎、叶浸取液对紫云英、黑麦草和早熟禾3种受试牧草植物幼苗生长均不存在统计学意义上的显著作用。而各类型浸取液处理下的3种植物幼苗芽高大多低于对照组，化感效应指数（RI）大多为负，这表明大狼毒浸取液对3 种植物幼苗芽高具有一定的负面影响。因此，无法判断大狼毒浸取液对植物幼苗生长是否存在化感作用。

3.2 讨论

植物化感作用是自然界中的一种普遍存在的生态机制，主要对植物种子的萌发及幼苗生长产生影响[21]。试验结果表明，大狼毒浸取液对退化高寒草甸3种典型牧草植物的种子萌发存在显著的化感抑制效应，且高浓度根浸取液的化感作用最强，这与程晓月等[22]的研究结果基本一致。种子萌发对物种更新而言十分重要，因为种子发芽率的降低会使得发芽时间延长，出苗推迟，进而影响到植物对地上、地下资源的竞争力[23-25,27]。因此，大狼毒的化感作用可能是造成滇西北高寒草甸原生植物的种类和数量发生减少，草甸质量不断退化的一个重要原因。同时，幼苗生长状况对于植物的发展而言也至关重要。刘桂霞等[26]发现大狼毒浸提液会影响受试植物的幼苗生长状况。在本试验中，虽然大狼毒浸取液对3种受试植物的幼苗生长均产生一定的负面影响，但不具有统计学显著性。

植物主要通过淋溶、挥发、根分泌和残体分解等途径释放化感物质[28]。在自然状态下，降水能将植物中的化感物质淋溶出来[29]，因此本试验采用植物水浸液来获取植物中的化感物质。事实上，单一的实验操作并不能完全反应出在自然环境中植物的化感作用强弱，受试植物的选择[11]、实验培养方式及受试植物的生长期等，都会对实验效果产生影响。试验选择了紫云英、黑麦草、早熟禾3 种滇西北高寒草甸的常见牧草，这3 种植物广泛分布于野外，对生境要求不高，生长和繁殖能力较强，植物本身抵干扰能力也比较强，使得其对大狼毒浸取液的化感物质存在一定的抵御力。而在已有的化感研究中，选取的受试植物为黄瓜、番茄、玉米等经过数代人工培育后的常见物种，往往抵抗力较弱。因此，植物间的化感作用十分复杂，不同受体植物对化感作用的敏感性存在差异[21,29]。其次，化感物质的作用机制也会影响实验效果，在自然环境中，化感物质释放后在土壤环境中往往要经过迁移、转化和吸附等过程再转移到邻近植物才产生作用。在此次幼苗生长实验中幼苗生长采用土培法，浸取液中的化感物质可能会被土壤的物理结构（如有机质含量、土壤孔径等）吸附，从而影响浸取液中的化感物质扩散。因此，植物化感作用产生效果需要达到一定浓度，土壤的吸附会降低浸取液浓度，削弱实验效果。另一方面，大量研究表明，实验室所用土壤与高寒草甸的天然土壤存在明显差异，这种差异体现在土壤pH值、微生物数量及其他元素含量[30]，这些均会对实验效果产生影响。最后，植物释放化感物质的量在不同发育时期也不尽相同，一般来说植物生长发育旺盛时期化感物质释放量最大。大狼毒花期6—8 月，而实验所用的大狼毒植株采集时间在8 月中旬，并未处于大狼毒化感物质释放最旺盛的时期，这可能会对后续实验产生一定影响。

探究大狼毒在滇西北高寒草甸退化中所起的作用，除了大狼毒对周围其他植物产生化感作用从而影响其种子萌发及幼苗生长外，大狼毒生长范围不断扩大并逐渐成为草甸优势种也是重要原因之一。大狼毒根茎粗大，吸水吸肥能力强，再生能力强，这决定了在高寒草甸中大狼毒生长能力、抵旱力等具有突出优势[6]，同时大狼毒的生物量相对较大，在冠幅覆盖范围下，其它植物的生长会受到抑制。另外，由于滇西北高寒草甸放牧区过度放牧，草甸承载力已不足，牧草植物再生受到抑制，而牛羊往往不食大狼毒，致使该物种生长空间逐渐扩大，日益成为高寒退化草甸上的优势种。

总之，滇西北退化高寒草甸大狼毒种群的扩散，对草甸造成了侵占性的物种干扰，如果不加以重视，这将会严重威胁到滇西北高寒草甸生态系统的未来可持续发展[6]。然而有研究表明[3]，大狼毒种群的扩散有利于草地土壤养分的转化和肥力状况的改善。李嘉懿等[31]对香格里拉大狼毒型亚高山草甸进行围封实验，发现由于家畜对优良牧草的采食和践踏得到了控制，草地早熟禾的地上生物量和盖度显著增加，大狼毒在群落中的优势度下降。这说明可以从本土牧草植物与大狼毒等毒害型植物之间的竞争关系中思考有效控制大狼毒蔓延的途径，比如针对滇西北高寒退化草甸区域的放牧现状，试行轮牧制，按周期划分休牧与放牧区，严格控制允许放牧的区域面积与牲畜量，利用休牧围封时间发挥大狼毒对土壤养分的促进作用，恢复休牧区的土壤肥力，同时在放牧区对大狼毒进行适当移除，在短期内控制其蔓延，从而保证优质牧草的生长，在一定程度上可以改善该区域过度放牧的问题。而针对牧民短期内可能存在的收入问题，当地政府可采取一定的生态补偿政策提供优惠。

针对大狼毒对滇西北高寒草甸退化的研究，还需要将土壤养分、肥力和水分与周围土壤中的化感物质及其作用机制[11]等纳入分析中，站在多重角度探讨大狼毒对草甸生态系统的实际利弊。再者，滇西北高寒草甸退化指示性植物还包括舟叶橐吾（Ligularia cymbulifera）等，在今后的研究中可将该植物对周围植物的化感作用与大狼毒进行对比分析，受试植物除本文中用到的3 种植物外还可选择其他本土牧草植物，探究其对化感作用的敏感度。同时，在研究大狼毒对本土植物的化感作用实验中，可增加发芽势、简明活力指数等生长指标及叶面积、总干重等形态学指标。另外，有研究表明，化感物质的抑制效果会随着时间的推移而削弱[32]，这说明时间尺度的把握对于化感作用实验来说十分重要，在下一步的研究中，有必要将短期实验与长期的野外监测结合起来，从而使研究结果更加适用于自然环境。

致谢：西南林业大学2019届毕业生潘兴婷同学在野外工作及数据处理中给予了协助，云南农业联合基金（2018FG001-027）同时对本研究给予了资助，谨致谢意！