兔粪与香油渣混合堆肥优势好氧发酵菌剂的筛选

张国言，杨萍萍，张连芝，孙桂阳，火兴宇，于 滨，董元杰*

(山东农业大学 a 资源与环境学院 b 动物科技学院，山东 泰安，271018)

兔粪和香油渣是本实验室前期工作中发现的代表性高纤维类动物粪便和高蛋白植物废弃物，具有碳氮比低，腐熟效率快的优点[1]。因此，采用好氧堆肥的方式[2]，将其制成高品质有机肥，是兔粪香油渣类农业废弃物资源化利用的有效方式，也是我国农牧废弃物无害化处理的重要途径[3]。在传统的好氧堆肥过程中，常利用发酵材料中的土著微生物进行发酵，往往会出现升温慢、腐熟时间长和腐熟程度不彻底等问题，无法有效转化保留养分和消除原料中的有害物质[4]。而添加外源微生物是一种很好的解决方法[5～7]。何宙阳等[8]研究表明，加入木质素纤维素降解菌可以显著提高堆体温度，延长高温时间，提高相关酶活性和降解速率。张玉凤等[3]发现，接种外源菌剂是物料快速腐熟、消除病虫害等不利因素的关键途径。王晓娟等[9]认为，添加外源微生物可以在堆肥初期加速基础物料的分解，有利于加快腐熟进程，同时增强土著微生物的繁殖能力。虽然我国登记在册的微生物菌剂生产企业较多，外源微生物菌剂产品也较多，但菌种质量良莠不齐，且绝大多数产品都是针对常见的全部畜禽粪便研制的，尚未有专门针对兔粪堆肥的发酵菌剂。为此，笔者选择10种市场常用发酵菌剂，调查发酵过程中物料理化性质变化以及测定产品养分情况，筛选适宜兔粪、香油渣为底物发酵的优良菌剂，为生产以兔粪和香油渣类农业废弃物为原料的高品质有机肥提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

(1)兔粪：成年家兔混合粪便，来自山东省泰安市某养殖场。

(2)香油渣：来自泰安市某小磨香油厂。

(3)微生物发酵菌剂：试验供试发酵菌剂10种(代号为T1～T10)，均为目前市场有机肥生产的主流产品，采用说明书的最大菌剂发酵用量，控制发酵底物质量一致，取相应分取倍数的菌液加入物料，控制各菌剂用量与物料量均符合说明上的最佳发酵比例，供试菌剂登记信息及主要成分见表1。

表1 试验所用发酵菌剂的基本信息

1.2 试验设计

试验设置11个处理，其中处理T1～T10分别为添加10种发酵菌剂的发酵组合，处理T0(兔粪+香油渣+木屑自然发酵)为对照(CK)，不添加外源菌剂。所有处理的兔粪辅料均相同，每个处理3次重复，兔粪占物料总质量(以干基计算)比例为54%，香油渣占41%，木屑占5%，使混合物料初始碳氮比m(碳)∶m(氮)=25∶1；堆肥物料中加入水，使水的质量分数为60%，pH约为7.0。堆肥材料的理化性质见表2。

表2 堆肥材料的基本理化性质

试验于2020年11月4～29日在山东农业大学南校区试验站进行，控制环境温度25 ℃。将自然风干的兔粪与粉碎成粉末状的香油渣混合，加入发酵菌剂、水、木屑等物料，充分混匀，然后运送至圆柱形发酵桶中，桶长1.8 m，宽1.2 m，物料体积占1/2，以保证通风和翻堆加水的空间。

1.3 测定方法

用水银温度计每天9：00和15：00测定堆体中心温度，根据温度变化分别在升温期(4 d)、高温期(9 d)、降温期(16 d)进行翻堆加水，同时翻堆前记录堆体含水率[10]，以控制堆肥进程和产品质量。分别在堆肥后第1，第8，第15，第24天采用5点取样法在堆体各部分取样1次，取样质量约250 g，样品混合均匀，测定pH，测定有机质、全氮、全磷、全钾等的质量分数，其方法均采用中华人民共和国农业行业标准有机肥料NY 525—2012规定的方法[11]。全碳使用元素分析仪(Elementar Vario EL，上海艾力蒙塔贸易有限公司生产)进行测定，有效磷和有效钾的测定参照农业行业标准NY/T300—1995[12]。铵态氮、硝态氮采用1 mol/L KCl溶液浸提，连续流动分析仪(AA3, 德国seal公司)上机测定。总腐殖酸含量测定采用焦磷酸钠浸提，浸提液经重铬酸钾-浓硫酸氧化后，利用硫酸亚铁滴定的方法进行测定。微生物含量测定采用平板菌落计数法[13]。

发酵结束后，采用发芽率试验以检测堆肥腐熟状况[3]，采用峰值法以检测堆体腐熟进程[14]。

1.4 数据分析

采用SPSS 22.0软件进行数据处理和分析，Microsoft Excel 2019，Matlab R2016a进行图表的制作，运用Duncan新复极差法比较各处理间的差异，设置显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同发酵菌剂对堆肥温度的影响

各处理堆体都经历了快速升温、高温、降温等3个阶段。在堆肥发酵前期，除对照外，全部处理的温度均呈迅速上升状态，其中处理T5，T6，T8升温较为迅速，分别在第5，第7，第7天就达到了50 ℃，除处理T9以外的其它菌剂处理均在第9天后升温到50 ℃(图1)，而T9和对照处理CK则始终未进入高温期。T9菌剂为偏向于猪粪等脂肪含量高的粪便发酵菌剂，富含的铜绿假单胞菌属于油脂类降解菌，对油脂含量低而纤维素含量高的兔粪作用效果较差，微生物营养来源不足，产热少难以升温；而CK的温度始终较低说明添加外源菌剂具有促进堆体升温的作用。其中，处理T5促进升温的效果最好，比其它处理提前2 d以上到达高温期。

从高温持续时间和最高温度来看，处理T5和T8高温期最长且达到的温度较高，高温期都持续了10 d且最高温度分别达到62.2 ℃和60.5 ℃。处理T1，T2，T4，T6，T7，T10的最高温度也都达到了55 ℃以上且持续时间在3 d以上，处理T3也维持50 ℃高温在24 h以上，符合我国粪便无害化卫生标准[3]。说明添加合适的发酵菌剂可以提高堆肥温度、延长高温时间，促进堆肥腐熟。

图1 不同菌剂对堆肥温度的影响

2.2 不同发酵菌剂对堆肥水的质量分数和pH的影响

在整个堆肥过程中，各处理混合料中水的质量分数都呈下降的趋势(图2a)。到堆肥结束时，下降幅度最大的处理有T5，T8和T1，下降幅度分别达到40.9%，38.7%和37.0%，混合料中水的质量分数均低于30%，符合我国有机肥国家标准[11]。其它菌剂处理中水的质量分数也都下降到35%以下，而CK中水的质量分数为最高(40.9%)，腐熟不彻底。可见，添加外源菌剂可以提高堆体温度，促进水分散失，加快腐熟进程，处理T5和T8效果较好。

在堆肥过程中，各处理pH整体呈上升趋势，至堆肥结束时各处理pH由高到低的顺序依次为：T4，T2，T1，T7，T8，T10，T3，T6，T5，T9(图2b)，而CK处理的pH偏低说明添加外源菌剂可以改善堆体酸碱环境，提高pH值，从而间接提高微生物活性，推进腐熟进程。

图2 不同发酵菌剂对堆肥水的质量分数(a)和pH(b)的影响

2.3 不同发酵菌剂堆肥浸出液对小白菜发芽指数的影响

不同发酵菌剂堆肥浸出液处理小白菜，其发芽率除处理T2外，其它各处理的发芽率均达到80%以上，以处理T5为最高，显著高于处理T2和T3(表3)；而处理T2的发芽率比CK降低了6.67个百分点，差异达到显著水平。说明选用合适的发酵菌剂生产有机肥对于植物生长好坏具有重要意义。发酵菌剂堆肥浸出液处理小白菜的根长，从长到短的顺序为：T8，T5，T6，T9，T4，T1，T7，T10，T3，T2。处理T8和T5的根长分别达到2.62 cm和2.18 cm，分别比CK提高了78%和48%。除处理T2外，其它菌剂处理的小白菜发芽指数显著高于CK，由大到小的顺序为：T8，T5，T6，T9，T4，T1，T10，T7，T3，T2。其中，处理T8和T5的效果更优，相比CK分别提升了100.0%和70.5%，说明接种合适的发酵菌剂能够大幅提高小白菜发芽指数，促进种苗生长。

2.4 不同发酵菌剂对堆肥全氮质量分数及C/N的影响

各处理全氮质量分数在整个发酵过程呈上升趋势，在堆肥结束时，全氮质量分数由高到低的顺序为：T5，T6，T8，T7，T2，T10，T4，T9，T1，T3。与堆肥初期相比，全氮提升幅度由大到小依次为：T5，T6，T8，T7，T4，T2，T9，T10，T3，T1(表4)。增幅最大的为处理T5和T6，分别比第1天增加了75%和57%，增加最少的为CK(13%)，说明添加外源菌剂可以减少氮的损失，提高氮素利用率。

堆肥结束时，各菌剂处理C/N均小于20，达到了腐熟的标准[13]，CK的C/N则较高，未完全腐熟(图3)。与第1天相比，各处理C/N下降幅度由大到小顺序为：T5，T8，T6，T2，T3，T7，T4，T1，T10，T9。下降幅度最大的处理T5和T8分别比初始值降低了61%和50%，同时比CK降低了55%和43%，这表明添加外源菌剂可以有效降低堆肥的C/N，推进堆肥腐熟进程，处理T5效果最为显著。

表3 不同发酵菌剂堆肥浸出液对小白菜发芽指数的影响

表4 不同菌剂处理堆肥全氮质量分数变化

注：图中不同字母表示不同处理之间差异达5%显著水平，下同。图3 不同菌剂处理堆肥C/N量

2.5 不同发酵菌剂对堆肥全磷和全钾质量分数的影响

各处理全磷的质量分数整体也呈上升趋势(图4a)。在堆肥结束时，各菌剂处理全磷质量分数高于CK，但差异不显著。与堆肥初期磷的质量分数相比，包括CK在内所有处理的全磷显著增加，增幅由大到小的顺序为：T8，T3，T2，T1，T4，T5，T10，T6，T7，T9。其中T8和T3处理全磷质量分数增加最多，分别达107%和94%。说明添加外源菌剂可以一定程度上提高堆体全磷质量分数。

各处理全钾质量分数呈上升趋势，其中第1～8天上升幅度最大，第8天后继续缓慢上升趋于稳定(图4b)。各菌剂处理全钾质量分数高于CK，增幅由大到小顺序为：T5，T3，T7，T1，T6，T2，T4，T8，T10，T9。其中，T5和T3处理钾的质量分数提升比例最大，分别比CK增加了23.9%和23.8%，全钾质量分数达到2.69%，其它菌剂处理间差异不显著，说明添加外源菌剂可以有效提高堆体全钾质量分数，T5效果最好。

图4 不同发酵菌剂对堆肥全磷(a)和全钾(b)质量分数的影响

2.6 不同发酵菌剂对堆肥速效磷和速效钾质量分数的影响

堆肥结束时，各菌剂处理的速效磷质量分数显著高于CK，增幅由大到小的顺序为：T3，T5，T7，T1，T2，T8，T9，T4，T6，T10(图5)。说明接种外源菌剂可以有效增加堆体速效磷质量分数。处理T3和T5增幅最大，分别为44%和39%，其与这2种菌剂含有较高含量的解磷菌有关。

各菌剂处理堆体的速效钾质量分数均高于CK，但差异不显著，增幅在10%～28%之间，堆肥结束时各处理速效钾质量分数均高于CK(图5)，说明接种外源菌剂能够一定程度上提高堆体速效钾的质量分数，其中处理T5效果较好，达到5 058 mg·kg-1，比CK增加了28.6%，这与各菌剂处理的全钾质量分数变化趋势一致，与T5菌剂含有解钾菌有关。

2.7 不同发酵菌剂对堆肥铵态氮和硝态氮质量分数的影响

各菌剂处理的堆肥铵态氮质量分数均呈先上升后降低的变化趋势(图6a)。堆肥结束时，各处理堆肥的铵态氮质量分数由高到低的顺序为：T9，T4，T10，T7，T3，T6，T1，T2，T8，T5，其中处理T5的铵态氮质量分数最低，比CK降低了10.6%。其它各菌剂处理的铵态氮质量分数也显著低于CK，说明CK发酵较慢且腐熟不彻底，而添加外源菌剂处理在促进有机态氮分解的同时也增强了氮的固定，有利于硝化作用而减少氨气损失，以处理T5最优。

各处理硝态氮的质量分数呈持续上升趋势，前8 d缓慢增加，随着堆肥高温期结束，硝态氮质量分数开始急剧上升(图6b)。与第1天相比，各菌剂处理的硝态氮质量分数增幅均大于200%，其中以处理T2，T5，T8的质量分数最高，均达到80 mg·kg-1以上；到堆肥结束时，各菌剂处理与CK相比，硝态氮质量分数增幅显著，其中以处理T5增幅最大，较初始时提升了115.1%，说明添加外源菌剂可以显著提高硝化作用速率，以处理T5效果最好。

图6 不同发酵菌剂对堆肥铵态氮(a)和硝态氮(b)质量分数的影响

2.8 不同发酵菌剂对堆肥有机质和总腐殖酸质量分数的影响

堆肥结束时，有机质质量分数由高到低顺序为：T4，T9，T10，T7，T6，T1，T2，T3，T8，T5。各菌剂处理的有机质质量分数均低于不添加菌剂的CK(图7a)，比CK降低了4%到28%不等，其中T5和T8的有机质质量分数最低，分别为573.6 g·kg-1和626.4 g·kg-1，相比CK分别减少了28.7%和22.2%，但依旧符合我国有机肥中有机质含量高于45%的标准[14]，已达到腐熟程度。方差分析可以看出，CK与各菌剂处理间差异性显著(P<0.05)，说明添加外源菌剂可以有效提高物料中有机质等含碳物质的转化速率，促进堆肥的腐熟进程。同时，T5与其它菌剂处理之间的差异性同样显著(P>0.05)，说明T5菌剂在促进有机质分解方面效果最好。

堆肥收获时，各处理间腐殖酸质量分数差异显著(图7b)，总腐殖酸质量分数由高到低顺序为：T5，T2，T8，T1，T3，T6，T7，T4，T10，T9，从63.1 g·kg-1到133.6 g·kg-1不等，除T9和T10外，其它菌剂处理腐殖酸质量分数均比CK增加35%以上，其中T5，T2和T8的腐殖酸质量分数更是比CK增加了112%，105%和88%，增幅显著；同时与有机质降低的趋势相吻合，证明添加外源菌剂有助于有机质腐殖化进程，提高腐殖酸产量，T5腐殖酸质量分数最高。

2.9 不同发酵菌剂对堆肥微生物量的影响

各处理在堆肥结束时微生物含量有明显差异(图8)。微生物总量由高到低顺序为：T5，T8，T7，T3，T1，T2，T6，T10，T9，T4。与CK相比，所有菌剂处理的微生物总量都显著提升，其中T5和T8处理最佳，比CK的微生物总量增加了470%和432%，均达到了3.5×107cfu·g-1以上，最差的处理T4也增加了46%，达到了1.01×107cfu·g-1，说明添加外源菌剂可以极显著的提高堆体微生物数量，加快堆肥发酵进程，T5表现最好。

图7 不同发酵菌剂对堆肥有机质(a)和腐殖酸(b)质量分数的影响

2.10 不同发酵菌剂处理堆肥成品三维荧光光谱特征

图8 不同发酵菌剂对堆肥微生物量的影响

利用荧光分光光度计测定全部处理堆肥成品，并对数据进行分析，之后筛选出3张代表性EEM谱图。3种不同处理条件下有机肥样品的三维荧光特性如图9所示。可以看出，各处理条件下的有机肥样品中均存在有较为明显的类腐殖酸物质峰(Ex/Em=390 nm/485 nm)。其中，T5处理样品中类腐殖酸物质最多，峰值强度为6 640，T9处理样品中较低，但峰值强度也达到了3 750，而不添加菌剂的CK处理中类腐殖酸物质峰值仅为2 545。与CK自然发酵相比，T5菌剂处理后的有机肥样品中类腐殖酸物质相对含量增加了2.61倍，且最次菌剂处理T9后类腐殖酸物质相对含量也增加了1.47倍。结果表明，堆肥结束时各菌剂处理之间类腐殖酸物质差异较大，但与CK相比均有利于腐殖酸类物质的形成，因此添加外源微生物对堆肥腐熟具有明显的促进作用，其中T5最佳。

注：(a)T5菌剂处理堆肥成品三维荧光谱图；(b)T9菌剂处理堆肥成品三维荧光谱图； (c)CK处理堆肥成品三维荧光谱图图9 不同处理堆肥成品三维荧光光谱

3 结论与讨论

3.1 讨论

水的质量分数是堆肥进程中重要的影响因素之一，过低或过高都不利于堆肥的快速腐熟。李丹阳等[15]以羊粪为原料研究含水率对堆肥腐熟度的影响，发现初始水的质量分数为65%左右是保持高温时间充足，有机质降解快的最佳比例。刘羽莲[16]研究表明添加微生物菌剂有助于堆体快速脱水升温以达到腐熟的目的。本次研究表明，添加外源菌剂的处理水的质量分数下降迅速，比对照提早进入后熟期。同时发现豫启富、依它和君德粪便发酵菌剂在第15天水的质量分数才大幅下降，其它处理的第8天就已经下降到50%以下，这可能是这3种菌剂升温较慢，在第13天才进入高温期所导致的，说明堆肥过程中含水量随高温期的到来而迅速下降，添加外源菌剂可以促进有机质的分解产生热量，加速水分蒸发，促进兔粪香油渣的好氧发酵进程。亨坤菌剂处理含水率下降最快，可能是其含有较多的嗜酸乳杆菌、链霉菌和高温放线菌等嗜热型微生物所致。

与其它菌剂相比，亨坤菌剂更利于兔粪和香油渣混合好氧发酵，其可能的原因是亨坤菌剂含有特异性菌株链霉菌、圆褐固氮菌、绿色木霉菌、丝状真菌、弧菌属和副球菌属细菌。链霉菌有利于堆肥的持续升温，促进堆体水分散失，提高腐熟效率。圆褐固氮菌的存在促进了堆肥过程中氮素的固定，减少氨气损失，提高氮素利用效率；绿色木霉、丝状真菌可以高效降解兔粪中丰富的纤维素类物质，为其它功能性微生物提供大量能源物质，从而加速了堆体的腐殖化进程，有利于优质有机肥的生产；弧菌属和副球菌属的细菌有利于硝态氮的合成，因而减少了堆肥过程中氨挥发损失量，减少氮损失，增加速效养分含量[18～20]。亨坤菌剂中这几种菌同时存在的交互作用可能大大提高了兔粪和香油渣堆肥材料的发酵腐熟，为最佳选择。本文后期可以进一步探明各菌株之间的交互作用及堆肥各阶段的微生物丰富度及优势菌种，为各菌株的协同作用创造有利条件，进一步促进兔粪和香油渣混合好氧发酵效率。

3.2 结论

综上，本次试验条件下，各供试菌剂发酵过程中，以亨坤菌剂温度上升最快，发酵效率较高；堆肥结束后，亨坤处理的C/N下降幅度最大，腐熟最为迅速。各菌剂处理氮磷钾总养分含量均处于较高水平，有机质含量均达到国家标准，小白菜种子发芽势均达到无害化标准。亨坤菌剂发酵产物微生物量较高更有益于堆体发酵。三维荧光光谱分析结果也表明，堆肥结束时亨坤菌剂发酵产物类腐殖酸物质含量最高，腐熟效果最好。综合各项监测指标，本次试验10种供试菌剂中，除常规菌株外，以链霉菌、圆褐固氮菌、绿色木霉菌、丝状真菌、弧菌属和副球菌属细菌为主要成分的亨坤菌剂发酵效果最佳，最适于兔粪和香油渣混合材料好氧发酵制备有机肥。