替米考星体外抑制蓝耳病病毒复制的研究

文│谭涛 梅小伟［礼蓝（上海）动物保健有限公司］

李燕华（扬州大学）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染导致的猪传染性病，其典型临床表现为生长猪呼吸道疾病及母猪繁殖障碍性疾病等。PRRS是当前仅次于非洲猪瘟最重要的猪传染病之一，对我国养猪业产生巨大威胁。PRRSV是一类有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目动脉炎病毒科，包含PRRSV 2型（北美型）和PRRSV 1型（欧洲型）两个基因型。中国境内流行的PRRSV毒株主要是北美型。目前在我国流行的优势毒株为HP-PRRSV、类NADC30-PRRSV毒株及其重组毒株。接种疫苗是当前防控PRRS的重要手段，由于PRRSV基因组快速变异，临床上不断有新的变异毒株出现，现有的PRRS疫苗对变异毒株的保护力有限，甚至会出现重组毒株和疫苗毒力返强的情况。

目前尚无针对PRRSV的特异性抗病毒药物，泰勇是礼蓝动物保健有限公司生产的替米考星预混剂，其主要抑菌活性成分是替米考星（含量为20%），临床上用于治疗猪胸膜肺炎，放线杆菌、巴氏杆菌、支原体等病原引起的感染。有研究表明，泰勇的主要活性成分替米考星可以抑制PRRSV在巨噬细胞中的复制，减轻蓝耳病的临床症状，改善猪只体增重。本研究在细胞感染水平上评估泰勇对我国流行的类NADC30（NL-1207）和HP-PRRSV（BLC-2）毒株感染的抑制作用。

一、材料与方法

1.细胞与病毒。猪的肺泡巨噬细胞取自3～4周龄的PRRSV抗原和抗体阴性仔猪的肺脏；本研究使用的PRRSV毒株为我国当前流行的L1谱系（类NADC30毒株NL1207）和L8谱系（HP-PRRSV毒株BLC-2）临床分离毒株（图1）。

2.主要试剂。泰勇（20%替米考星预混剂），RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（诺唯赞），HiScriptRII One Step qRT-PCR Probe Kit（诺维赞），CCK-8 Cell Counting Kit（诺唯赞），PRRSV RT-qPCR检测的引物与探针。

3.泰勇溶解与定量。将500毫克泰勇加入到10毫升分析纯的甲醇中，4℃过夜，旋转混匀后在4℃的冷冻离心机中离心沉淀不可溶的部分（暗黄色的外衣），将上清液通过细菌滤器（0.22微米孔径），分装后冻存于-20℃备用。此溶液的浓度为10毫克/毫升。

4.泰勇对病毒悬液中PRRSV的作用。将一定浓度的泰勇（0、10、20、40、80微克/毫升）与PRRSV（1 MOI）病毒液混合，室温处理1小时后感染肺泡巨噬细胞。感染后2小时去除病毒和药物上清，PBS漂洗两次，24小时后收集病毒上清。通过RT-qPCR法检测病毒上清中的病毒基因组拷贝数，比较药物处理组与对照组病毒复制情况，判定泰勇对PRRSV是否有直接杀灭作用。

5.泰勇对肺泡巨噬细胞内PRRSV的作用。将一定浓度的泰勇（0、10、20、40、80微克/毫升）预先处理肺泡巨噬细胞，再接种PRRSV（1 MOI）。感染2小时后去除病毒上清液，漂洗未结合的病毒，加入与前处理相同浓度的泰勇。在细胞培养箱中孵育24小时后收集病毒上清。通过RT-qPCR检测病毒上清中的病毒基因组拷贝数，比较药物处理组与对照组病毒的复制情况，判定泰勇对PRRSV感染的抑制作用。

6.统计分析。运用GraphPad Prism 8.0软件中的ANOVA分析方法对数据进行生物统计学分析，P＜0.05表示组间差异显著。

◎图3 泰勇抑制PRRSV（类NADC30毒株NL1207和小时P-PRRSV毒株BLC-2）在肺泡巨噬细胞中的复制

二、试验结果

1.泰勇的抗病毒活性成分溶于甲醇但不能溶于水和乙醇。泰勇为颗粒状的替米考星预混剂，为了便于在细胞水平上进行抗病毒试验，本试验尝试了超纯水、乙醇和甲醇等溶解其抗病毒成分。运用这3种溶剂，分别配制了10毫克/毫升的泰勇浸出液。PRRSV（NL1207）抗病毒试验结果表明，溶于甲醇的泰勇浸出液能显著降低PRRSV感染后细胞上清中的病毒基因组拷贝数；水和乙醇溶解泰勇的能力较弱。因此，本研究选择甲醇为溶剂配制泰勇浸出液。

2.泰勇不能直接灭活PRRSV。当前我国流行的PRRSV毒株的遗传多样性非常复杂，主要为类NADC30毒株和HP-PRRSV毒株。本研究使用类NADC30毒株NL1207和HP-PRRSV毒株BLC-2用于研究泰勇的抗病毒作用。我们首先测试了泰勇是否能直接灭活NL1207和BLC-2两个毒株。将不同浓度的泰勇与PRRSV（1 MOI）混合，室温孵育1小时，感染肺泡巨噬细胞，收集感染24小时后的病毒培养物。RT-qPCR检测结果表明，泰勇处理后感染肺泡巨噬细胞的病毒产量与对照组无显著差异（图2），与先前研究结果一致，泰勇不能直接灭活PRRSV。

3.泰勇抑制PRRSV在肺泡巨噬细胞中的复制。泰勇浸出液可抑制PRRSV在猪肺泡巨噬细胞中的复制。收集感染24小时后的培养物，并提取RNA，RT-qPCR检测结果表明，泰勇的浓度大于20微克/毫升时，类NADC30毒株NL1207和HP-PRRSV毒株BLC-2在肺泡巨噬细胞上的复制被显著抑制（图3）。当泰勇的浓度为80微克/毫升时，对NL1207和BLC-2毒株抑制效果最明显，抑制倍数分别为8.3和4。以上结果显示，泰勇能间接抑制PRRSV在猪肺泡巨噬细胞中的复制。

三、结论与讨论

该研究评价了替米考星（泰勇）对我国当前流行PRRSV毒株的抑制作用。抗病毒试验结果表明，泰勇显著抑制不同谱系PRRSV在猪肺泡巨噬细胞中的复制，但不具有直接灭活PRRSV的能力。也就是说，替米考星（泰勇）是通过肺泡巨噬细胞间接抑制PRRSV复制。

根据国外报道，替米考星的抗病毒机理是升高巨噬细胞内溶酶体的pH，从而导致PRRSV的复制速度减慢，替米考星自身带有碱性基团，使其容易向酸性溶酶体聚集，减弱PRRSV的脱壳反应，降低复制速度。

另外，替米考星还可调节炎症因子表达，减轻炎症反应，降低肺部损伤。替米考星作为大环内酯类抗生素具有抗菌作用，这使得猪群在PRRS感染后继发的细菌性疾病也可得以控制，临床上替米考星可以和磺胺类等药物共同使用，降低感染猪群死亡率，有效降低PRRS和继发感染造成的经济损失。