壳聚糖仿生黏合剂的一步原位制备及性能研究

2022-07-06刘慧清陈河操张春亚郭旭虹

华东理工大学学报(自然科学版) 2022年3期

刘慧清，张鹏，陈河操，张春亚，郭旭虹，王杰

（华东理工大学化工学院，大型工业反应器工程教育部工程研究中心，化学工程联合国家重点实验室，上海 200237）

水凝胶得益于其优异的生物相容性、伤口适应性以及潜在的自愈合及抗菌性能，近年来在组织黏合剂、骨骼及眼修复、药物缓释等诸多前沿领域得到了广泛关注[1-6]。尽管水凝胶组织黏合剂与传统固定材料（如缝合线、骨钉）相比，具有治疗创伤小、操作简单且避免二次创伤等优点，但是冗长的合成路径、严苛的储存条件限制了其在临床上的大量应用[7]。

受限于富含体液的使用环境，目前组织黏合剂主要通过模仿海洋贻贝丝足的黏附机理来实现耐湿黏附性能[8-9]。研究表明，贻贝丝足中富含邻苯二酚的蛋白质和Fe3+等无机离子，Fe3+与多巴的氧化配位双重交联作用是贻贝能够实现水下黏附的重要原因[10]。由此，以壳聚糖、透明质酸、海藻酸、纤维素等天然高分子为主链，经由酰胺化、席夫碱等反应制备邻苯二酚改性的高分子凝胶前体，最后使用高碘酸钠（NaIO4）、生物酶（如辣根过氧化物酶/双氧水，HRP/H2O2）、Fe3+等作为交联剂制备组织黏合剂已经成为开发新型黏合剂的关键途径[11-14]。然而，NaIO4的潜在生物毒性、生物酶严苛的储存条件，以及此类路径中涉及的复杂反应、提纯过程均阻碍着仿生组织黏合剂的进一步应用。因此，实现组织黏合剂的快速简便制备具有极为重要的开发价值。

Xu等[3]和Yang等[5]分别通过羧甲基壳聚糖与海藻酸钠二醛、聚甲醛葡聚糖大分子之间的席夫碱反应，无需交联剂便实现了水凝胶载体的原位制备，该水凝胶生物相容性优异，被成功用作眼部药物治疗的缓释材料。此外，组织黏合剂的便捷制备也取得进展。Nghi等[15]报道了利用羧甲基壳聚糖与醛基透明质酸大分子之间的席夫碱反应，一步原位制备抗炎组织黏合剂。尽管上述研究的合成路径便捷，然而邻苯二酚基团的缺失，使得上述水凝胶的耐湿黏附强度与力学性能仍有不足。

如上所述，受贻贝足丝蛋白的启发，学者们相继开发了一系列具有耐湿黏附能力的组织黏合剂，简化黏合剂的合成路径，实现仿生黏合剂的快速制备正逐步成为新的研究热点。本文以生物相容性、抗菌性、生物可降解性优异的天然碱性氨基多糖−壳聚糖（CS）作为高分子骨架[16-17]，分别以3,4-二羟基苯甲醛（DBA）和Fe3+作为黏附基团和交联剂，采用一步原位法快速制备含邻苯二酚基团的耐湿组织黏合剂；同时，以传统的席夫碱-还原反应路径将邻苯二酚基团接枝到壳聚糖主链上得到胶前体[2]，然后配制水凝胶。随后，探究了壳聚糖、邻苯二酚含量以及Fe3+浓度对上述两种方法制备凝胶过程及性能的影响；分析比较了两种方法所得黏合剂的性能差异；最后，考察了一步原位法所制备的黏合剂材料的表面适应性及稳定性。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

CS：生物试剂，中黏度，脱乙酰度90%，南通飞宇生物科技有限公司；DBA：生物试剂，纯度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸（HCl）：纯度36%～38%，上海泰坦科技股份有限公司；冰醋酸：纯度99.5%，上海麦克林生化科技有限公司；硼氢化钠（NaBH4）：纯度98%，上海泰坦科技股份有限公司；六水三氯化铁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇：分析纯，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 实验仪器

采用SHIMADZU UV-2550型紫外-分光光度计（日本岛津公司）表征反应情况与测定接枝率，波长范围250～500 nm；采用Anton-Paar MCR 501型流变仪（奥地利安东帕公司）进行流变学分析：平台直径25 mm, 样品间距0.5 mm；采用HY-0580型万能拉伸机（上海衡翼公司）定量测试黏合剂的黏合强度：拉伸速率5 mm/min。

1.3 邻苯二酚-壳聚糖凝胶的制备

1.3.1 一步原位法一步原位法通过CS上氨基与DBA上醛基之间的席夫碱反应（图1（a）），同时经由Fe3+与DBA上羟基之间的氧化配位双重交联作用[10]，仅通过简单的机械混合（无需任何提纯）便可快速制备凝胶。

首先将适量的壳聚糖溶解于一定浓度Fe3+溶液中待用，紧接着配制一定浓度的DBA的乙酸溶液，最后将两溶液均一混合，可立即制备得到不同原料配比的棕黑色凝胶，整个制备过程仅需几分钟。本文以CS-DBA-Fe-x-y-z的形式命名样品，即根据CS的质量分数（%），DBA的浓度（mol/L）与Fe3+的浓度（mmol/L）来命名所得凝胶。例如，CS-DBA-Fe-1.5-0.2-15，表示溶有质量分数为1.5%壳聚糖的15 mmol/L Fe3+溶液，与0.2 mol/L的DBA溶液来原位制备凝胶。文中将CS与DBA混合溶液简称为CS-DBA。

1.3.2 席夫碱-还原法传统的席夫碱-还原法的反应过程如图1（b）所示。称取0.2000 g CS完全溶解于40 mL乙酸溶液（φ=1%，pH≈5）后，分别称取0.1715 、0.5147、0.8579 、1.2010 g DBA完全溶于10 mL乙醇溶液中（CS与DBA的物质的量之比为1∶1、1∶3、1∶5、1∶7）。在剧烈搅拌下，将完全溶解于乙醇中的DBA溶液逐滴加入CS溶液中，溶液于45 ℃下避光避氧反应24 h。随后，在反应液中分多次加入过量NaBH4，产生大量白色气泡，体系由黄褐色均一溶液逐渐变浑浊，同时有灰白色沉淀析出，还原时间2 h。抽滤后保留滤饼，所得滤饼置于去离子水中，用盐酸调节pH值直至产物完全溶解得澄清溶液。产物溶液分别在φ=1%的醋酸与去离子水中透析6 h，再冷冻干燥，所得产物（以下简称为CCS）冷藏保存[1]。

图1 CS-DBA（a）与CCS（b）的合成路线图Fig. 1 Synthesis process of CS-DBA (a) and CCS (b)

完成胶前体的制备后，分别配制一定浓度CCS水凝胶的Fe3+溶液，以小瓶倾倒法测定样品的凝胶时间。类似地，凝胶以CCS-Fe-x-y的形式进行命名，即根据CCS溶液的质量分数(%)与Fe3+的浓度(mmol/L)来命名。例如，CCS-Fe-1.5-248表示以质量分数为1.5%的CCS溶液与248 mmol/L的Fe3+溶液进行混合来制备相应的水凝胶。

1.4 产物的紫外光谱表征

采用紫外-可见光分光光度计表征CS与DBA的反应情况，利用DBA的吸光度标准曲线测定CCS的接枝率。

分别配制10、8、5、3.3、2.5、2 μg/mL的DBA的乙酸溶液，以紫外-可见光分光光度计测得上述各溶液在281 nm处的吸光度，利用origin软件线性拟合得到DBA溶液质量浓度与吸光度之间关系的标准曲线。随后将所得产物CCS溶解于50 mL、φ=1%的乙酸溶液中，得到其在281 nm处的吸光度，最后利用测定得到的标准曲线计算其接枝率。

1.5 黏合剂的溶胀率测试

首先采用一步原位法制备CS-DBA-Fe水凝胶，并在既定时间内固化，经冷冻干燥后，记录其质量，记为m0。随后，将水凝胶浸没在φ=1%的乙酸溶液中，一定时间后取出溶胀的凝胶，用滤纸小心去除表面残余的溶液，记录其质量，并记为mt。水凝胶溶胀率（S）的计算公式为S=（mt−m0）/m0，记录水凝胶溶胀率随时间的变化情况。

1.6 黏合剂的黏合强度测试

将尺寸为25 mm×25 mm脱水处理后的猪皮固定在铝板上，分别在两块猪皮上均匀涂覆300 μL CSFe3+（溶解在铁离子溶液里的壳聚糖）溶液以及150 μL DBA溶液，将两块猪皮搭接在一起后用夹子小心固定，最后在37 ℃下固化2 h。以万能拉伸机来测定黏合剂的黏附性能，拉伸速率为5 mm/min，黏合强度的计算公式为σ=F/(a×b)，其中σ为黏合强度(MPa)，F为测试中最大拉伸作用力（N），a和b分别为黏合区域的长和宽（mm）。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱表征

图2示出了CS-DBA和CCS溶液的紫外光谱图，DBA溶液的紫外标准曲线以及不同取代度CCS产物溶液的紫外光谱如图2（a）所示，CS溶液在250～500 nm范围内无吸收峰，DBA溶液在281 nm和310 nm处具有邻苯二酚以及醛基的特征峰，产物CS-DBA溶液则在281nm和343 nm处拥有两个特征峰，分别归属于邻苯二酚及席夫碱产物的C＝N键[12,18]。图2（b）中，席夫碱-还原法所制得的CCS胶前体溶液，在281 nm处也出现了邻苯二酚中苯环的特征峰，这表明两种方法均成功将黏性成分DBA接枝到壳聚糖的大分子链上。

图2 CS-DBA溶液（a）、CCS溶液（b）的紫外光谱图；DBA溶液紫外标准曲线（c）；不同接枝率CCS溶液的紫外光谱（d）Fig. 2 UV-Vis spectra of CS-DBA (a) and CCS (b) solution; UV-Vis standard curve of the DBA solution (c); UV-Vis spectra of the CCS solution with different graft yield (d)

CCS胶前体的接枝率如表1所示。由表可得，DBA占比逐渐增加时，CCS胶前体中DBA的接枝率逐渐增加，但是反应的转化率逐渐减小。换言之，反应物DBA过量后，参与反应的DBA绝对数量提升，但是若考虑参加反应的DBA质量与总DBA质量的比值，则反应转化率是降低的，这主要是由于DBA接枝后带来的空间位阻效应所导致的[12]。下文中若无特殊说明，均使用nCS∶nDBA=1∶5时所得的CCS胶前体（接枝率13.37%）开展实验。

表1 nCS∶nDBA对CCS胶前体接枝率的影响Table 1 Effect of nCS : nDBA on the graft yield of CCS precursor

2.2 红外光谱表征

图3示出了CS、CS-DBA、CCS的红外光谱图。如图3所示，CS中3350 cm−1处为O−H与N−H的伸缩振动峰，2870 cm−1处为C−H伸缩振动峰，1645 cm−1处归属于CS酰胺I区的伸缩振动峰（乙酰基的C＝O双键伸缩振动峰）[19-20]，1590 cm−1处归属于CS酰胺II区的振动吸收峰（N−H的弯曲振动峰与C−N的伸缩振动峰）[21]，1070 cm−1与1020 cm−1处则是CS中C−O典型的伸缩振动峰[2]。与之相比，CCS与CSDBA的红外光谱图中，两者1590 cm−1处酰胺II区的振动吸收峰均得到加强，这是两产物中分别产生的C−N、C＝N吸收峰与酰胺II区的振动吸收峰叠加的结果，并且两者在1500 cm−1处均出现归属于邻苯二酚的伸缩振动峰[2]。上述结果说明，DBA成功接枝到CS的大分子骨架上。

图3 CS、CS-DBA、CCS的红外光谱图Fig. 3 FT-IR spectra of CS, CS-DBA and CCS

2.3 成胶时间的测定

图4示出了CCS聚合物质量分数、Fe3+浓度对CCS-Fe黏合剂成胶时间的影响，以及CS质量分数、DBA浓度、Fe3+浓度对CS-DBA-Fe黏合剂成胶时间的影响。如图4(a)、4(c)、4(d)所示，当两体系中CCS、CS聚合物质量分数、DBA浓度增大时，成胶时间均逐步下降。这主要是由于聚合物质量分数或DBA浓度增大时，单位溶液体积内参与交联的氨基或邻苯二酚基团数量增加，成胶速率加快，使得成胶时间下降。不过，采用一步原位法制备的黏合剂在聚合物质量分数为1%时便可实现水凝胶的制备，在2%时成胶时间已基本稳定，相比传统席夫碱-还原法路径的制备条件更加温和。另外有所不同的是，如图4(b)、4(e)所示，成胶时间不总是随Fe3+浓度的增大而下降，这主要是由于Fe3+的氧化配位双重交联作用所导致的。当Fe3+浓度较低时，其倾向于与邻苯二酚基团进行交联速度更快的多配位作用；当Fe3+浓度较高时，它则倾向于与邻苯二酚进行单配位（交联速度更快的二配位、三配位作用降低，且单配位对交联程度无促进作用），从而降低交联速度，导致成胶时间的上升[10]。

图4 CCS聚合物质量分数（a）、Fe3+浓度（b）对CCS-Fe黏合剂成胶时间的影响；CS质量分数（c）、DBA浓度（d）、Fe3+浓度（e）对CS-DBA-Fe黏合剂成胶时间的影响Fig. 4 Influence of CCS polymer mass fraction (a) and Fe3+ concentration (b) on the gelation time of CCS-Fe adhesive; Influence of CS mass fraction (c), DBA concentration (d) and Fe3+ concentration (e) on the gelation time of CS-DBA-Fe adhesive

2.4 黏合剂的流变学分析

图5示出了Fe3+双重交联水凝胶CS-DBA-Fe体系的流变性能，以及其与NaIQ4共价交联水凝胶的流变性能比较。如图5（a）所示，当水凝胶CS-DBAFe中CS、DBA的含量增加时，所得水凝胶将拥有更高的储能模量G'，这表明单位体积内数量更多的成胶基团将对水凝胶的交联程度有利，与成胶时间测定的结果相符。如图5（b）所示，Fe3+浓度逐步增加时其氧化性质逐渐增强，所得水凝胶的黏弹性也随之增强（更接近于共价交联水凝胶）。需要指出的是，NaIO4诱导的共价交联水凝胶（图5（b））表现出典型的弹性体特征（即G'>G''，且两者随频率变化的波动较小）[22-23]。然而，一步原位法制备的CS-DBA-Fe水凝胶展示出独特的流变性质，既不是单纯的氧化交联体系也不是纯粹的配位交联体系，而是氧化-配位共存的双重交联体系[10,22-23]。

图5 CS-DBA-Fe水凝胶(a)和NaIO4共价交联水凝胶(b)的流变性能Fig. 5 Rheological properties of CS-DBA-Fe hydrogel (a) and NaIO4 covalently cross-linked hydrogels (b)

2.5 黏合剂的溶胀度测定

溶胀是水凝胶最基本的性质之一，溶胀度可以反映水凝胶与溶液的相互作用情况以及水凝胶内部的交联程度[24]。因此，本文以溶胀度的测定来反映由Fe3+氧化配位双重交联作用所制得的水凝胶的稳定性。如图6所示，成胶时间分别为0.5、2 h和24 h的水凝胶在0～2 h的溶胀初期迅速吸水，溶胀度迅速增加。待约4 h后，三者的溶胀度趋于稳定，这主要是由于水凝胶内部的吸水-失水速率达到平衡。需要指出的是，以上三者水凝胶均可在水中稳定存在85 h以上，其中仅有CS-DBA-Fe-2-0.25-10（0.5 h）水凝胶出现少量失重，但主体仍保持完整。结果表明，配位作用的存在并未显著降低水凝胶的稳定性，一步原位法所制备的样品成胶速度优异，且性质稳定。

图6 CS-DBA-Fe黏合剂的溶胀度测试Fig. 6 Swelling ratio test of CS-DBA-Fe adhesive

2.6 黏合强度的测定

首先，初步考察了一步原位法所得CS-DBA-Fe黏合剂对不同材料表面的适应性。如图7(a)所示，仅需少量CS-DBA-Fe黏合剂便可牢固黏连60 g塑料、100 g玻璃、120 g金属以及80 g陶瓷等材料，极大地拓展了其潜在应用场景。这主要源于黏合剂表面富含的邻苯二酚基团与各基板表面存在较强的氢键作用、疏水作用、静电作用以及配位等作用。此外，邻苯二酚还可与组织表面蛋白中的氨基形成强作用，使其成为组织黏合剂开发所需的关键成分。如图7(b)所示，相较于质量分数为3%的CCS溶液，CCS-Fe-3-248水凝胶的黏合强度由8.1 kPa显著增加至29.8 kPa，这说明Fe3+的氧化配位作用显著增加了黏合剂的力学强度。相比之下，一步原位法所制备的CS-DBA-Fe-3-0.25-25黏合剂拥有更高的黏合强度（达到48.8 kPa）。CCS胶前体制备时，以盐酸中和过量NaBH4还原剂，可能导致壳聚糖的部分降解，使其分子量下降[25]，另外高浓度胶前体数小时的溶解时长也可能导致其部分氧化，从而造成其黏合性能不佳。最后，进一步增加CS-DBA-Fe-3-0.1-10中的DBA、Fe3+浓度，黏合强度从43.0 kPa略微增加至48.8 kPa，这主要是由于CS-DBA-Fe-3-0.1-10中的各组分浓度条件已可实现水凝胶的充分交联，因而黏合强度增加不大，与成胶时间、流变性质中的测定结果基本一致。

图7 CS-DBA-Fe黏合剂的材料表面适应性（a）；CS-DBA-Fe与CCS-Fe的黏合强度（b）Fig. 7 Material surface adaptability of CS-DBA-Fe adhesive (a); Adhesion strength between CS-DBA -Fe and CCS-Fe (b)