向日葵抗列当育种研究进展

郭树春 苗红梅 李素萍 于海峰 聂 惠牟英男 温馨雨 梁 晨 张海斌 邵 盈

（1河南省农业科学院，450002，河南郑州；2内蒙古自治区农牧业科学院，010031，内蒙古呼和浩特；3内蒙古乌兰察布市察右中旗大滩乡人民政府，013558，内蒙古乌兰察布）

向日葵（Heliauths annuus L.）起源于北美洲，属菊科向日葵属一年生草本植物，具有抗逆性强和适应性广的特点，是世界四大油料作物之一[1]。世界上有40多个国家种植向日葵，其中种植面积较大的国家有俄罗斯、乌克兰、阿根廷、罗马尼亚、中国等[2]。向日葵籽油是南美洲国家、俄罗斯、法国及部分东欧国家的主要食用油[3]。向日葵籽是东南亚国家主要休闲食品之一[4-5]，也是重要的工业原料，在东南亚的市场需求旺盛，其次籽粒还是一种优质的饲料原料。目前，向日葵籽在炒货和籽仁市场中的消费量呈上升趋势。在我国，向日葵是改良盐碱地的先锋作物，也是重要的经济作物，在农业经济结构调整中具有不可替代的作用。

向日葵列当（Orobanche cumana Wallr.）属列当科列当属植物，寄生在向日葵等寄主根部引起植株茎秆低矮细弱，产量和品质明显降低，甚至整株死亡，对向日葵生产危害严重[6]。19世纪上半叶人们认为向日葵的寄主是蒿属（Artemisia spp.）植物，Antonova[3]研究发现向日葵更合适列当寄生。此后，随着不同国家和地区向日葵种植面积的扩大，向日葵列当的发生及危害也愈渐严重[7]。向日葵列当具有很强的传播和突变能力[8]。单株列当会产生数千个微小的种子，种子大小为200～300μm，且很容易被风和其他媒介（包括向日葵种子和农机具等）传播[9]。列当种子从无限花序蒴果中释放后，可在土壤中休眠长达数十年之久[10]，可在寄主植物根系分泌物的诱导下发芽[11]，开始新的寄生生活。

据估计，地中海和西亚地区有1600万hm2的土地受到列当影响[12-13]。据统计[14-16]，在易感列当品种种植区，由列当侵染造成的损失超过50%，受侵染严重的田地可达100%。黄长权[17]研究表明，单株向日葵被5株列当寄生时，株高降低11.8%，茎粗降低15.2%；寄生40株时，株高和茎粗分别降低40.9%和39.2%。任文义等[18]研究发现，单株向日葵上列当寄生数为10～20株时，向日葵减产30%，寄生数为30株以上时，会造成80%的减产；寄生数量达到50株以上时其产量近乎绝收。在选用非抗性品种条件下，选用合理的管理和栽培方法，可以降低列当对其生产的不良影响。研究证明，使用化学方法控制列当是可行的，但高成本和污染环境问题限制了其推广与应用。使用抗列当品种是控制寄生性列当的最佳方法。培育抗列当品种的基础是挖掘有效抗源，然而，这是一项长久持续的工作，因为一旦发现对现有小种的抗源，列当就会进化出更具毒性的生理小种。向日葵抗列当基因有单基因和多基因遗传抗性的报道[19]。目前，向日葵列当正在我国快速蔓延，对向日葵产业的影响日趋严重。

向日葵列当已成为研究重点，本文侧重于通过育种手段提高向日葵对列当的抗性，尤其是通过分子育种得到对毒力更强的列当小种具有抗性的向日葵品种进行了综述。同时还开展生理小种的结构和分布、定性和定量抗性基因在提高向日葵抗性中应用以及分子标记辅助选择等方面的研究。此外，展望了在今后工作中要充分利用生物技术工具，如基因组学和基因编辑技术，以实现向日葵对列当的持久抗性，为向日葵抗列当育种研究提供理论依据，对我国向日葵生产可持续发展具有一定的应用价值。

1 向日葵列当生理小种分布

向日葵列当具有宿主特异性，这一现象在寄生植物中很少见[20]。向日葵列当以自花授粉为主，因此其种群间遗传多样性很高[21]。向日葵列当基因组较小，易受环境影响而突变，其群体进化速度快，且存在生理小种分化的现象[22]。在列当属植物中，一种向日葵列当生理小种类型（根据其毒力强弱，以A、B、C…小种顺序表示）对应一种特定的向日葵抗列当基因型，表现出明显的种族结构。目前已知的向日葵列当生理小种有8种（A～H）。

据文献[2]记载，第一次发现了列当存在不同生理小种，鉴定出与之对应的抗列当品种，并区分了2个向日葵列当生理小种，即A和B。后来，随着新的生理小种C的出现，严重影响向日葵生产，A和B的遗传抗性因此而变得无效[21]。研究发现，在一段时间内新的抗列当向日葵种质的引入可控制列当的发生，但随着环境压力的增加，新的毒性更强的列当小种就会出现，并使原有的抗原失去效力。目前，向日葵列当存在的地区有所有南欧国家、黑海周边地区、北非、以色列和中国[16]。据报道[23]，俄罗斯南部地区存在多种列当生理小种，已命名为F、G和H。继F小种之后，在罗马尼亚和西班牙相继发现了致病力更高的G小种，该生理小种能够在抗F小种的向日葵寄生[7,24]。2014年，Kaya[6]报道称，在土耳其发现一种新的向日葵列当，其致病力比当时已发现的向日葵列当小种都高，并将其命名为生理小种H。2011年，Dicu等[25]在罗马尼亚也发现了向日葵列当生理小种H。Hablak等[26]在乌克兰东北部观察到H小种的存在，以及毒力高于H小种的向日葵列当生理小种。摩尔多瓦向日葵列当不同生理小种的空间分布不均，在该国中部地区较低毒力的小种占主导地位，而在南部和北部地区高侵染性生理小种占主导地位，超过60%的列当样本归类为G和H小种[27]。罗马尼亚2005年就出现了高毒力G小种[28-29]。

不同国家向日葵列当生理小种的组成情况有所不同。Shindrova[30]于2000-2004年间在保加利亚向日葵主产区采集列当种子，然后利用成套鉴别寄主对其生理小种进行鉴定，结果表明保加利亚存在D、E和F小种，其中E小种的分布区域最为广泛，F小种存在于中北部的个别区域。Shindrova[30]于2012年对保加利亚116份向日葵列当进行了生理小种鉴定，发现有E、F、G和H生理小种，其中E和G小种的分布最为广泛，F小种有零星分布，H小种为首次发现。Pacureanu-Joita等[31]对西班牙向日葵列当进行了生理小种鉴定，发现西班牙向日葵列当主要由E小种组成，但也有F小种的存在。Dedic等[32]对塞尔维亚伏伊伏丁那省向日葵列当致病力分化及分布进行了研究，发现B小种是该省南部主要的小种类型，而E小种则是该省北部地区主要的小种类型。Molinero-Ruiz等[33]在西班牙北部地区也发现了列当的传播，其中生理小种F最具毒力。

对中国列当小种结构和分布分析，发现A～G小种在我国均有不同程度的存在[4]。1996年，董百春等[34]利用源自西班牙的5份向日葵列当国际鉴别寄主，采用人工接种方法对吉林省3个向日葵列当群体进行了生理小种鉴定，结果证明它们均属于生理小种A。马德甯等[35]于2014年对来自内蒙古、新疆、甘肃、吉林和黑龙江等地的向日葵列当进行了生理小种鉴定，发现这些向日葵列当样本中包含有生理小种A到F的全部类型。石必显等[36]利用向日葵列当国际通用鉴别寄主，对我国不同省区29个地点的向日葵列当进行鉴定，发现向日葵列当生理小种A、D、E、F和G的存在，其中D小种是优势生理小种。

2 向日葵抗列当遗传改良

2.1 向日葵抗列当品种选育

抗列当品种的成功选育很大程度上取决于相关性状的遗传变异[37]，抗性品种可阻碍列当在向日葵根部的寄生，从而达到防治的效果。由于栽培向日葵的遗传多样性相对狭窄，因此现有遗传资源是非常宝贵的变异来源；通过引入重要农艺基因，可提高向日葵栽培品种的抗性和品质性状。此外，野生向日葵和世界各地研究机构开发的栽培向日葵的基因库是向日葵列当抗性的重要来源，可通过自交与杂交等手段为特定品系引入列当抗性。

目前，通过种间杂交、自交和回交等手段可将向日葵野生种H.tuberosu的抗性基因导入栽培材料，并已成功选育出抗生理小种E、F和G的向日葵新品种[38]。Joel[39]将向日葵野生种H.maximiliani Schrad，H.grosseserratus Mart和 H.divarticatus与常规栽培种交叉种植，培育出4个（BR1-BR4）抗小种F品种。陈燕芳等[40]从原有感列当“三道眉”群体中寻求抗源，采用连续自交选择纯化的方法成功选育出抗列当食葵新品种622。由此可见，现有栽培向日葵基因库也是列当抗性的重要来源，这些基因库由不同类型的种群和近交系组成。Joita等[7]从罗马尼亚农业研究与发展研究所的栽培向日葵基因库中鉴定出对F和G小种有抗性的LC1093、LC009和AO-548品系，这些研究所开发和改良的向日葵抗列当材料极大地丰富了向日葵遗传资源多样性，为向日葵抗列当育种做出了巨大贡献。

2.2 向日葵抗列当基因

抗性育种是一项持续性很强的工作，其中包括发现和创制抗性基因。Vranceanu等[19]鉴定了5个抗列当单显性基因（以Or1、Or2、Or3…表示），成功培育出抗E小种的自交系和杂交种，提高了欧洲和亚洲等区域的向日葵产量。通过培育抗性品种防治列当简单易行，能够有效控制列当蔓延，已成为向日葵抗列当育种的首选手段[41]。然而，由于该寄生性列当的快速进化，该类型抗性很容易被打破[37,42]，这主要是由不同列当生理小种的特异性导致，如由基因Or6控制的抗性基因对F及以下生理小种有效[43-44]。Goncharov[45]研究表明，向日葵列当G小种的致病力极强，其所对应的抗性基因为Or7。

除了对向日葵列当的垂直抗性研究外，人们从分子遗传水平揭示向日葵列当抗性的复杂性，对向日葵列当不同生理小种特异性抗性的数量位点已有报道[44,46-48]，利用不同的定位群体，在不同遗传区域定位了一个控制列当抗性的QTL。QTL基因定位法的主要优点是，除可以定位主效QTL外，还可对列当抗性影响较小的互补QTL定位，并可作为标记辅助选择的有效标记。Pérez-Vich等[44]研究表明，QTL对列当抗性并不总是与抗性亲本的等位基因相对应，在某些情况下，它是由易感亲本的等位基因赋予的。向日葵抗列当育种的主要目的是培育携带所需目的基因的高产向日葵资源。由此可见，对高毒力小种有抗性的向日葵基因型是稀缺抗性基因的来源，并可用于区分高级别列当小种。此外，获得抗特定列当生理小种的基因序列信息，能够对向日葵抗性和列当小种进行更加准确的区分。

2.3 向日葵抗列当遗传多样性分子标记

拥有单一列当抗性的基因型往往在很短的时间内就会失去抗性。例如，当携带Or5基因的向日葵遇到毒性更强的小种时，就会失去抗性，因此，要培育持续抗列当品种，需要采取新的策略，如主效基因聚合或垂直抗性与水平抗性聚合等[19]。将1个以上的基因和QTL聚合于1个材料，迫使列当克服2个或更多基因的抗性，达到持续抗列当目的。但传统育种手段很难实现上述目标，因此，通过MAS进行基因聚合是快速遗传改良的有效方法。与表型选择育种相比，分子标记辅助选择是一种简单、高效、准确的方法，在抗病育种中更为方便[49]。由于栽培向日葵对列当的抗性需引入不同来源材料的抗性基因，可利用不同类型的分子标记定位和鉴定抗性基因的位置和序列信息，从而聚合多个抗性基因。随着更复杂的向日葵抗列当数量遗传信息的出现，分析和鉴定抗列当基因将变得更具现实意义和挑战性。

到目前为止，已经明确了一些向日葵抗列当分子标记或基因。张明等[50]利用抗F小种列当材料和高感材料，根据BSA法建立了抗、感池，对分布在17个向日葵连锁群上的409对SSR引物进行筛选，共筛选到77个多态性SSR引物，从这些引物中筛选到4对可将抗—感单株、抗—感混池明确区分开的引物，它们可能是抗F小种通用分子标记引物。Tang等[51]定位了一个抗列当E小种的单基因Or5所连锁的SSR分子标记，发现该基因定位在LG3的顶端，距离最近的标记是CRT392，为5.6cM。此外，Pérez-Vich等[44]在第7条染色体上检测到5个抗E小种的QTL和6个抗F小种的QTL，研究确定E小种抗性表型变异主要由第3染色体上与抗性或易感性状相关的主效QTL产生。Imerovski等[52]通过SSR标记得到抗列当F小种的基因仅在LG3上显示多态性，与该基因最接近的标记为Orabvl-8，暂命名为ORS683，遗传距离为1.5cM。虽然该基因与Or5在同一条染色体上，但这2个抗性基因是不同的。Or5基因位于第3染色体上端，最近的公共标记ORS1036位于下游7.5cM处，而Orabvl-8定位于第3染色体下端。Imerovski等[48]在第3染色体上定位了2个抗列当主要QTL，分别命名为QTL or3.1和QTL or3.2，前者定位于Or5的基因组区域，后者首次定位于同一染色体的下游区域，并发现第3染色体存在抗性QTL，根据杂交结果，在向日葵基因组中定位了2～23个显著QTL，并在距SSR标记ht0464-ca约3cM处的LG4位点上推测了列当小种H的抗性位点，2个SNP标记（HT0183和HT090）被鉴定为潜在的重要标记。Louarn等[47]鉴定了2个生理小种（F小种来自西班牙，G小种来自土耳其）在向日葵3个发育阶段的不同QTL，并在9条染色体上定位了17个QTL，其中只有1个QTL在2个小种的抗性上共定位。最近研究[53]发现基因HaOr7已被定位到第7条染色体上。

2.4 向日葵抗列当基因信息

近年来，随着植物全基因组、蛋白质组和代谢组取得进展，可在全基因组水平挖掘和鉴定抗性基因和蛋白。最近公开的向日葵基因组序列为向日葵基因组的开发奠定了坚实的基础[53]。Duriez等[54]结合基因组学和图谱克隆技术，定位和鉴定了HaOr7基因对列当F小种的抗性功能。该基因位于一个约55kb的窗口。为了获得亲本基因组序列，从易感株系和抗性株系中建立并筛选了2个BAC文库。通过比较发现HaOr7基因起源于野生向日葵。将该序列与XRQ易感F小种的参考序列进行比较，发现HaOr7基因编码了一个完整的LRR蛋白激酶，而在易感向日葵品系中，该蛋白无跨膜和激酶结构域。HaOr7阻止了向日葵根与维管系统的连接，其在列当早期发生阶段起作用。Imerovski等[48]分析了3个不同的杂交组合，在3号染色体上发现了QTL峰显著的区域。在主效QTL or3.1（31.9～38.48Mb）共鉴定出123个基因，选出HanXRQChr03g0065701（RPS2抗病蛋白）和HanXRQChr03g0065841（TMV抗病蛋白）基因。在该QTL or3.2共鉴定出71个基因，分布在97.13～100.85Mb，其中包括1个防御基因HanXRQChr03g0076321。考虑到QTL or3.1附近区域之前已鉴定为携带对E小种具有完全抗性和对F小种具有部分抗性的Or5基因[43,51]，推测QTL or3.1可能是Or5基因，详见表1。

表1 向日葵抗列当抗性基因及其序列信息Table 1 Sunflower resistance gene and its sequence information

3 展望

列当是影响向日葵产业发展的重要因素之一。目前，仍未培育出持续抗列当的品种。最近，向日葵基因组测序结果的公布为列当小种无毒力鉴定、向日葵抗性基因定位和基因间调控关系明确奠定了基础，可以更好地理清向日葵抗列当机制以及挖掘新的抗性基因。基因编辑技术的发展有助于更快地设计出优异的列当抗性基因类型，促进聚合抗性的产生，但由于向日葵再生出苗困难和转化率低等难点，致使基因编辑技术和基因沉默技术难以应用于向日葵育种。因此，使用现代基因编辑技术的第一步需要建立完善的向日葵再生、转化体系，此外，将垂直抗性研究与水平抗性研究结合，开展分子标记辅助育种、转基因技术育种和多基因聚合分子育种等多种育种方式，培育持续抗列当向日葵新品种，是现代向日葵育种家的目标之一。