麻疯树油体钙蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

蒲芝雨 黄建辉 李国泽 丁勇

摘要 [目的]克隆麻疯树（Jatrapha curcas）油体钙蛋白基因JcCale26.8全长cDNA序列，探究麻疯树油体钙蛋白及其基因的结构与功能。[方法]应用RNA-seq测序和PCR技术，从麻疯树种子中克隆获得1个油体钙蛋白家族基因JcCale26.8，并进行测序和序列分析。[结果]JcCale26.8基因序列含有6个外显子和5个内含子，内含子剪接位点符合真核生物基因的GT-AG法则。JcCale26.8基因mRNA序列的完整开放阅读框长717 bp，推测编码由238个氨基酸组成、相对分子量为26.8 kD的油体钙蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成，并具有油体钙蛋白典型结构特征，与来自蓖麻、川桑和异色山黄麻等多个不同物种的Caleosin蛋白具有较高的同源相似性。[结论]该研究可为麻疯树油体钙蛋白基因的表达调控与功能研究奠定基础。

关键词 种子;油体;麻疯树;油体钙蛋白;基因克隆

中图分类号 S 794.9  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0086-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.022

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Sequence Analysis of Caleosin Gene JcCale26.8 in Jatropha curcas

PU Zhi-yu，HUANG Jian-hui，LI Guo-ze et al

（Key Laboratory of Forest Biotechnology in Yunnan，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224）

Abstract [Objective]To clone the full-length cDNA sequence of JcCale26.8 gene from J.curcas and investigate the structure and function of caleosin and its gene in J.curcas seeds.[Method]This study used RNA-sequencing and PCR technology to clone a caleosin family gene JcCale26.8 from J.curcas seeds.Then the sequence of gene JcCale26.8 were sequenced and analyzed.[Result]The DNA sequence of JcCale26.8 gene contains 6 exons and 5 introns.The splicing sites of introns conform to the GT-AG rule of eukaryotic genes.The full-length mRNA comprised 717 bp nucleotides consisting of an open reading frame encoded a putative JcCale26.8 comprising 238 amino acid residues with molecular weight of 26.8 kD.JcCale26.8 protein is mainly composed of α-helix and random coil structure，and has the typical structural characteristics of caleosin.It has high homology and similarity with caleosin proteins from many different species such as Ricinus communis，Morus notabilis and Trema orientalis.[Conclusion]The  study can lay the experimental foundation for the study of the expression regulation and function of caleosin gene in J.curcas.

Key words Seed;Oil body;Jatropha curcas;Caleosin;Gene cloning

油體是脂质（主要是三酰甘油）储存库，主要存在于种子和衰老的叶片中[1]。油体不仅在植物生长发育过程中发挥重要作用，还能参与胁迫响应和激素信号通路等过程[2]。油体由外部完整的磷脂单分子层和围绕着疏水核心的膜蛋白组成[3]，这些膜蛋白包括油质蛋白（Oleosin）、油体钙蛋白（Caleosin）和油体固醇蛋白（Steroleosin）[4]。Oleosin是植物油体特有，且最为丰富的结合蛋白[5-6]，与油体大小和种子萌发率密切相关，并能增强植物种子的抗冻性[4]。Caleosin作为油体上的微量结合蛋白，最早发现于水稻（Oryza sativa）颖果发育时期的细胞膜上[7]，其在植物种子萌发过程中参与脂质降解[8]、油体形成[9]及维持油体的稳定[10]，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）的非种子组织中，Caleosin还表现出过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶活性[11]，参与抵抗逆境胁迫[11]和植物开花调节[12]等过程。

麻疯树（Jatrapha curcas）又名黄肿树（广东）、芙蓉树、假花生（广西）、高桐（云南）、吗哄罕（傣名）、桐油树（台湾）、南洋油桐（日本），为大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属（Jatropha）植物，主要分布于热带和亚热带地区，在我国半野生或栽培种植面积较广，资源丰富[13]。成熟麻疯树种子的含油量高达36%[14]，野生麻疯树种仁的最高含油量约60%，超过油菜和大豆等常见的油料作物[15]，因此开展麻疯树油体结合蛋白及其基因结构与功能研究对于其在油供工业方面的开发利用具有重要意义。而基因克隆与序列分析是开展不同生物目标基因功能研究的前提[16-18]。目前，Oleosin和Caleosin油体结合蛋白基因已经在水稻[7]、芝麻（Sesamum indicum）[9]、油菜（Brassica napus）[19]、拟南芥[20]和蓖麻（Ricinus communis）[21]等不同植物成熟种子中被克隆获得。有关麻疯树中Oleosin及其基因序列和结构特征已有研究[22-24]，但关于麻疯树Caleosin及其基因的研究鲜见报道。笔者以麻疯树种子为材料，应用RNA-seq和PCR技术克隆麻疯树Caleosin基因序列并进行分析，为完善对麻疯树油体膜蛋白的认识及后续解析Caleosin在麻疯树中的基因表达特征和功能发挥奠定试验基础。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 试验材料为3年生麻疯树植株发育40 d的麻疯树种子，取自西双版纳热带植物园，液氮速冻后放置于-80 ℃冰箱中保存备用。

RNA提取Trizol试剂和新型快速植物基因组DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品，反转录（5 × All-In-One RT MasterMix）和PCR（Kodaq 2 × PCR MasterMix with dye）试剂盒为爱必梦（abm）公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 核酸提取与检测。

将麻疯树种子种壳去除，取种仁于液氮中研磨并用于核酸提取。总RNA的提取按照Trizol试剂使用说明书进行，基因组DNA的提取按照OMEGA公司新型快速植物基因组DNA提取试剂盒使用说明书进行;基因组DNA和总RNA的完整性和纯度分别用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nano Photometer分光光度计（IMPLEN CA USA）检测。

1.2.2 麻疯树种子RNA-seq测序及目标基因挖掘。

检测合格的总RNA样本送至安诺优达基因科技（北京）有限公司，构建文库后利用Illumina平台进行RNA-seq测序，原始下机序列（Raw Reads）通过去低质量序列、去接头污染等过程完成数据处理得到高质量的序列（Clean Reads）。对质控后的高质量序列进行组装，再基于组装序列结果进行ORF及功能预测分析，从RNA-seq数据库中挖掘具有潜在Caleosin功能结构域的目标cDNA序列。

1.2.3 麻疯树JcCale26.8基因cDNA序列克隆验证。

在目标基因cDNA序列ORF区两侧设计特异性引物对F（5′-AGATGGCTACTAGAACGGACG-3′）和R（5′-GCCACCATTGCTTTACATTCT-3′），并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取总RNA样品为模板，按照反转录试剂盒说明书进行第一链cDNA的合成。取反转录产物cDNA 模板2.0 μL，R和F引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，Kodaq 2 PCR MasterMix 12.5 μL，Nuclease-free H2O 9.5 μL，建立25 μL PCR反应体系。PCR反应程序：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃變性30 s，53.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，38个循环，72 ℃延伸10 min。

1.2.4 麻疯树JcCale26.8基因DNA序列克隆。

取“1.2.1”步骤中提取的高质量gDNA样品3 μL为模板，R和F为引物对，进行JcCale26.8基因DNA序列的PCR扩增，反应体系和扩增条件同“1.2.3”。

1.2.5 PCR产物检测回收与克隆测序。步骤“1.2.3”和“1.2.4”中PCR产物采用1.0%琼脂凝胶电泳检测，目的片段回收后与pMD19-T载体连接，转化DH5a感受态细胞，经复苏后涂布在LB固体培养基上（含Amp、IPTG和X-Gal）培养，蓝白斑筛选阳性克隆，委托上海生工生物技术服务有限公司测序。

1.2.6 JcCale26.8基因的生物信息学分析。应用表1显示的网站对JcCale26.8基因及推导编码的蛋白质序列进行对应项目内容的分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取和JcCale26.8基因的cDNA序列克隆分析

植物组织总RNA样品的纯度和完整性是基因克隆等分子生物学试验成功的关键因素[25-26]。该试验获得的发育40 d 麻疯树种子总RNA完整性好，显示28S和18S rRNA条带清晰，点样孔无亮斑，无弥散拖尾，且前者条带的亮度约为后者的2倍（图1）;总RNA的A260/A280比值在1.8～2.0，说明纯度好且无蛋白质、多糖和酚类物质等杂质污染[27]。符合RNA-seq建库测序和基因克隆试验要求。试验构建的麻疯树种子RNA-seq数据库共获得33 902个Unigene，GC含量占40.72%，总碱基数达33 168 384个，从中挖掘获得2条cDNA序列具有潜在Caleosin功能结构域（表2），序列S1和S2均具有完整ORF区域。以具有较长ORF区的序列S1为目标进行克隆验证分析。按“1.2.3”进行RT-PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳结果（图2）显示，在对应DL2000分子量标准的750 bp条带处出现1条符合预期大小的主条带，经胶回收T/A克隆测序，获得与转录组数据库Unigene序列S1引物间完全一致的长738 bp的cDNA序列。长1 026 bp的目标序列S1推导编码分子量为26.8 kD的Caleosin蛋白，因此命名为JcCale26.8基因。该试验获得JcCale26.8基因cDNA序列全长1 026 bp，1～43 bp为5′UTR，761～1 026 bp为3′UTR，位于826～831 bp的一致性序列AATAAA和2个U-rich单元（位于957～964 bp和1 016～1 021 bp处）为预测的PolyA信号位点;44～760 bp为完整ORF，推测编码由238个氨基酸组成的Caleosin蛋白JcCale26.8。

2.2 JcCale26.8基因DNA序列克隆与分析 该试验提取的麻疯树种子基因组DNA完整性好、纯度高。DNA样品条带清晰单一（图3），点样孔无亮斑，无弥散拖尾，其A260/A280值为1.96。以提取的高质量DNA样品为模板，按“1.2.4”进行PCR扩增获得大于2 000 bp的DNA条带（图4），克隆测序结果为2 018 bp的JcCale26.8基因组DNA序列。经DNA和mRNA序列比对分析（图5）显示，JcCale26.8基因含有6个外显子和5个内含子。内含子位于JcCale26.8基因DNA序列116～395、546～1 008、1 095～1 271、1 367～1 464、1 591～1 674 bp，每个内含子序列5′端为GT、3′端为AG，均符合真核生物基因内含子剪接位点的GT-AG规则。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

2.3 JcCale26.8基因序列分析

通过 NCBI 网站 Blast 工具和CD-Search服务器对麻疯树JcCale26.8基因编码的238个氨基酸序列进行相似性搜索分析和功能域分析，结果（图6）表明，目的基因编码的麻疯树28.6 kD的Caleosin蛋白为Caleosin蛋白超家族成员，具有典型的Caleosin功能结构域。该蛋白序列与NCBI登录的来自麻疯树的未知蛋白JCGZ 02382（KDP40384.1）和过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶（Peroxygenase，POG） 异构体X1 （XP 012069904.1）的氨基酸序列具有100%的一致性，表明该试验成功克隆获得的麻疯树Caleosin蛋白可能具有POG酶活性。

JcCale26.8和其他物种Caleosin蛋白或具有POG酶活性的Caleosin蛋白具有较高的同源性（表3），与来自蓖麻（Ricinus communis）（XP_002528367.1）、川桑（Morus notabilis）（XP_010089211.1）、爱玉子（Ficus pumila var.Awkeotsang）（ABV72237.1）、异色山黄麻（Trema orientalis）（PON94834.1）等17个不同物种间的Caleosin蛋白同源相似性均达70%以上，其中与蓖麻的同源相似度最高，达87.07%。基于MEGA-x软件构建的系统进化树（图7）显示，爱玉子（ABV72237.1）、杨梅（Myrica rubra）（KAB1219333.1）和川桑（XP_010089211.1）聚为一个分支，且与JcCale26.8的亲缘关系最远;JcCale26.8与蓖麻（XP_002528367.1）、野大豆（Glycine soja）（KHN30721.1）的Caleosin蛋白聚为一个分支，表明JcCale26.8与蓖麻和野大豆中具有POG酶活性的Caleosin蛋白亲缘关系较近。

蛋白质理化性质分析结果显示，JcCale26.8蛋白分子式为C1218H1829N317O350S10，相对分子量26.83 kD，等电点5.50;JcCale26.8蛋白由除天冬酰胺（Asn，N）外的19种常见氨基酸组成，亮氨酸（Leu，L）含量最高为8.8%，半胱氨酸（Cys，C）含量最低为0.8%，其他氨基酸含量在2.1～8.0%，氨基酸组成差异较小;负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）有28个，正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）有22个;摩尔消光系数（extinction coeffificients）为45 505，不稳定系数（Instability index）为52.01。蛋白信号肽分析显示，无信号肽酶酶切位点（图8），推测JcCale26.8属于不稳定的非分泌性酸性蛋白质。

疏水作用在维持蛋白质高级结构稳定中发挥着重要作用，较高正值的氨基酸具有较强的疏水性，而较低负值的氨基酸则具有较强的亲水性。通过在线软件ExPASy对JcCale26.8进行蛋白质亲疏水性分析，结果（图9）显示，大部分氨基酸为负值，表现为亲水性，尤其是N-末端、127～150位氨基酸残基和C-末端表现为较明显的亲水区，第46位氨基酸残基处亲水性最强（-2.144）;87～107位和182～201位氨基酸残基处表现出较明显的疏水性，99和100位氨基酸残基疏水性最强（3.067），推测JcCale26.8为两亲性蛋白。基于TMHMM在线软件分析结果显示，JcCale26.8蛋白无明显的跨膜结构域（图10），推测该蛋白可能以中间疏水区域锚定在油体膜表面而发挥作用。

二级结构预测结果显示，JcCale26.8主要由无规卷曲（46.64%）和α-螺旋（35.29%）结构构成，还含有少量的延伸链（10.92%）和β-转角（7.14%）等二级结构。无规卷曲主要位于第3～7、13～27、31～38、42～59、80～83、107～122、128～138、146～149、160～168、179～184、207～210位氨基酸残基区域，α-螺旋结构主要位于第8～12、60～67、84～89、94～105、150～159、169～177、185～207、211～218、234～238位氨基酸残基区域，延伸链主要位于第68～70、77～79、103～104、123～127、139～141、198～202、222～225位氨基酸殘基区域，β-转角主要位于第72～75、90～91、143～145、205～206、219～220、231～232位氨基酸残基区域（图11）。

蛋白质三级结构预测（图12）显示，JcCale26.8主要由9个α-螺旋和无规卷曲结构构成，模型置信度为97.7%，符合二级结构预测结果。根据三维结构预测结果，并结合亲疏水性、跨膜结构和二级结构预测结果，预测麻疯树JcCale26.8蛋白符合油体钙蛋白典型结构特征，包括可结合钙离子的N端亲水区，中间含有脯氨酸的疏水区和C端的磷酸化位点[28]，可能在油体的形成及调动中传递信号，在种子萌发过程中通过信息转运来启动分解油体内中性脂肪产生能量。

3 结论与讨论

Caleosin是一种与植物油体发育发生密切相关的油体结合蛋白之一，其编码基因已从水稻[7]、芝麻[9]和拟南芥等[21]多种植物中克隆得到，不同植物的Caleosin蛋白序列具有较高的同源性，尤其是具有结合单一钙离子的EF-hand保守域，并类似主要油体结合蛋白 Oleosin 能与油体相结合等特性[29]。该试验通过RNA-seq和PCR技术从麻疯树成熟种子中成功克隆了编码26.8 kD Caleosin蛋白的JcCale26.8基因mRNA和对应基因组DNA序列，推测编码的JcCale26.8蛋白明显具有Caleosin蛋白结构特征，并与已知多种植物Caleosin蛋白具有较高的序列相似性。0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

对JcCale26.8基因序列进行生物信息学分析发现，该序列早期在Zhang等[30]对盐胁迫下麻疯树幼苗叶片的基因组测序数据库中（PRJNA63485）分析拼接获得，并被注释为未知蛋白JCGZ_02382（KDP40384.1），而Jalali等[31]对麻疯树基因组进行测序获得的数据库（PRJNA673911）进行分析拼接获得了该序列，并根据同源性自动被注释为POG （XP_012069904.1） 基因蛋白，但并未得到研究。有研究发现，Caleosin在非种子组织中表现出POG活性[32]，因而目前在NCBI数据库中具有Caleosin功能结构域的Caleosin蛋白序列多数被注释为POG蛋白。为了探究麻疯树油体钙蛋白及其基因的结构与功能，笔者从麻疯树种子中克隆分离了JcCale26.8基因mRNA和DNA序列，序列特征分析结果表明JcCale26.8基因表达产物为植物Caleosin蛋白家族成员，而在麻疯树中JcCale26.8基因表达产物JcCale26.8蛋白是否具有POG酶活性仍需要深入研究。

Caleosin在植物中通常由多基因家族编码，分子量一般在25～35 kD。目前已至少在15种植物中鉴定出了84个Caleosin基因[33]，如拟南芥基因组中鉴定出了8个Caleosin基因[34]，榛子（Corylus avellana L.）基因组中鉴定出5个Caleosin基因[35]，油菜（Brassica napus）中至少包含25.0、27.0、28.1 kD 的 3 个Caleosin 蛋白成员[29]。推测在麻疯树中至少存在4个Caleosin家族异构体蛋白。该试验克隆分离了26.8 kD的Caleosin基因序列，同时该试验麻疯树种子转录组数据库结果中还显示有另一具有Caleosin功能结构域的119个氨基酸残基组成的推测13.7 kD的Caleosin基因序列;根据对NCBI登陆的麻疯树基因组数据库PRJNA673911显示的另外2个POG酶蛋白序列XP_020534220.1和XP_012072291.2分析显示， XP_020534220.1（NCBI注释为peroxygenase isoform X2）序列蛋白为206个氨基酸残基组成的22.9 kD的Caleosin，XP_012072291.2（NCBI注释为probable peroxygenase 4）序列蛋白为249个氨基酸残基组成的28.7 kD的Caleosin。因此，推测以上4个序列对应的蛋白均属于Caleosin超家族成员。这可为后期开展麻疯树Caleosin家族蛋白的深入研究提供参考。

参考文献

[1]

SHIMADA T L，HAYASHI M，HARA-NISHIMURA I.Membrane dynamics and multiple functions of oil bodies in seeds and leaves[J].Plant physiology，2018，176（1）：199-207.

[2] CHAPMAN K D，DYER J M，MULLEN R T.Biogenesis and functions of lipid droplets in plants[J].Journal of lipid research，2012，53（2）：215-226.

[3] LAIBACH N，POST J，TWYMAN R M，et al.The characteristics and potential applications of structural lipid droplet proteins in plants[J].Journal of biotechnology，2015，201：15-27.

[4] ITABE H.Intracellular lipid droplet-associated proteins：Unique members and their biological functions[J].Biological and pharmaceutical bulletin，2010，33（3）：341.

[5] CAPUANO F，BEAUDOIN F，NAPIER J A，et al.Properties and exploitation of oleosins[J].Biotechnology advances，2007，25（2）：203-206.

[6] 孫静，姜宇，陶俊.植物油质蛋白的结构、功能及应用[J].植物生理学报，2018，54（3）：363-369.

[7] FRANDSEN G，MLLER-URI F，NIELSEN M，et al.Novel plant Ca2+-binding protein expressed in response to abscisic acid and osmotic stress[J].The journal of biological chemistry，1996，271（1）：343-348.

[8] POXLEITNER M，ROGERS S W，LACEY SAMUEL A，et al.A role for caleosin in degradation of oil-body storage lipid during seed germination[J].The plant journal，2006，47（6）：917-933.

[9] CHEN J C F，TSAI C C Y，TZEN J T C.Cloning and secondary structure analysis of caleosin，a unique calcium-binding protein in oil bodies of plant seeds[J].Plant and cell physiology，1999，40（10）：1079-1086.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

[10] JIANG P L，TZEN J T C.Caleosin serves as the major structural protein as efficient as oleosin on the surface of seed oil bodies[J].Plant signaling behavior，2010，5（4）：447-449.

[11] PARTRIDGE M，MURPHY D J.Roles of a membrane-bound caleosin and putative peroxygenase in biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis[J].Plant physiology and biochemistry，2009，47（9）：796-806.

[12] BLE E，BOACHON B，BURCKLEN M，et al.The reductase activity of the Arabidopsis caleosin RESPONSIVE TO DESSICATION 20 mediates gibberellin-dependent flowering time，abscisic acid sensitivity，and tolerance to oxidative stress[J].Plant physiology，2014，166（1）：109-124.

[13] 韋剑锋，韦冬萍，吴炫柯，等.麻疯树种子特性及其影响因素研究进展[J] .种子，2013，32（2）：51-55.

[14] LIU H，WANG C P，KOMATSU S，et al.Proteomic analysis of the seed development in Jatropha curcas：From carbon flux to the lipid accumulation[J].Journal of proteomics，2013，91：23-40.

[15] 邓志军，程红焱，宋松泉.麻疯树种子的研究进展[J].云南植物研究，2005，27（6）：605-612.

[16] 郑元，罗娅娜，罗玛妮娅，等.牛樟芝羊毛甾醇合成酶基因AcLSS的克隆和表达分析[J].西南林业大学学报（自然科学），2021，41（3）：94-99.

[17] 阳江华，张希财，邹智.橡胶树捕光叶绿素 a/b 结合蛋白基因CAB2的克隆与分析[J].西南林业大学学报（自然科学），2019，39（1）：88-94.

[18] 徐志文，任雪敏，赵满，等.黄粉甲储存蛋白hexamerin基因的克隆及表达分析[J].西南林业大学学报（自然科学），2019，39（4）：96-102.

[19] NSTED H，FRANDEN G I，JAUH G Y，et al.Caleosins：Ca2+-binding proteins associated with lipid bodies[J].Plant molecular biology，2000，44（4）：463-476.

[20] JOLIVET P，ROUX E，DANDREA S，et al.Protein composition of oil bodies in Arabidopsis thaliana ecotype WS[J].Plant physiology and biochemistry，2004，42（6）：501-509.

[21] HYUN T K，KUMAR D，CHO Y Y，et al.Computational identification and phylogenetic analysis of the oil-body structural proteins，oleosin and caleosin，in castor bean and flax[J].Gene，2013，515（2）：454-460.

[22] 熊宏，陈海涛，宋健，等.麻风树油质蛋白JcOle16.6基因克隆及序列分析[J].江苏农业科学，2016，44（6）：84-89.

[23] 宋健，熊宏，余进德，等.麻疯树油质蛋白JcOle14.3基因克隆及序列分析[J].中南林业科技大学学报，2016，36（6）：15-22.

[24] 余进德，熊宏，宋健，等.麻疯树种子发育过程中JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达模式研究[J].广西植物，2017，37（9）：1096-1100.

[25] 徐秋红，章镇，佟兆国，等.山梨醇对李果肉组织总RNA提取的影响[J].江苏农业学报，2010，26（2）：390-394.

[26] 张君堂，陶承光，王志刚，等.Trizol-A+试剂法提取百合总RNA[J].江苏农业科学，2009（2）：35-36.

[27] 丁勇，李涛，龚秀会，等.3种杜仲枝叶总RNA提取方法的比较[J].江苏农业科学，2011，39（5）：29-31.

[28] 向兰舟，胡娅晴，谢涵，等.拟南芥油体钙蛋白基因CALEOSIN 3对胁迫环境及ABA诱导的响应[J/OL].分子植物育种，2021-01-22[2021-04-27].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.2021，20210122.1218.004.html.

[29] 丁勇，陈庆波，徐春雷，等.油菜油体钙蛋白基因BnClo1的克隆和表达[J].作物学报，2008，34（11）：1921-1928.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7

[30] ZHANG L，ZHANG C，WU P Z，et al.Global analysis of gene expression profiles in physic nut （Jatropha curcas L.） seedlings exposed to salt stress[J].PLoS One，2014，9（5）：1-9.

[31] JALALI K，KANCHARLA N，YEPURI V，et al.Exploitation of Hi-C sequencing for improvement of genome assembly and in-vitro validation of differentially expressing genes in Jatropha curcas L.[J].3 Biotech，2020，10（5）：307-321.

[32] HANANO A，ALKARA M，ALMOUSALLY I，et al.The peroxygenase activity of the Aspergillus flavus caleosin，AfPXG，modulates the biosynthesis of aflatoxins and their trafficking and extracellular secretion via lipid droplets[J].Frontiers in microbiology，2018，9：1-19.

[33] SONG W L，QIN Y J，ZHU Y，et al.Delineation of plant caleosin residues critical for functional divergence，positive selection and coevolution[J].BMC evolutionary biology，2014，14（1）：1-14.

[34] SHEN Y，XIE J，LIU R D，et al.Genomic analysis and expression investigation of caleosin gene family in Arabidopsis[J].Biochemical and biophysical research communications，2014，448（4）：365-371.

[35] LAMBERTI C，NEBBIA S，BALESTRINI R，et al.Identification of a caleosin associated with hazelnut （Corylus avellana L.） oil bodies[J].Plant biology，2020，22（3）：404-409.0D9E048B-6BF5-4DF0-A58B-5397006E25A7