不同盐浓度胁迫对绿豆种子萌发及抗盐性的影响研究

马瑜蔓 牛思源 乔宁 苏之涵 刘彩虹 任琴*

（集宁师范学院，内蒙古 乌兰察布 012000）

1 前言

土壤盐渍化是一个世界性的资源和生态问题。全球盐碱地面积已达 9.5×108hm2（公顷）。中国盐渍土总面积约 1 亿公顷，其中现代盐渍化土壤约 0.37 亿公顷，残余盐渍化土壤约 0.45 亿公顷，潜在盐渍化土壤约 0.17 亿公顷。据联合国环境规划署（UNEP）的调查统计，在旱地土壤退化中，因土壤盐渍化造成的土地荒漠化达 110 万公顷以上，仅次于风蚀和水蚀，居第三位。全世界可耕地面积的20%和灌溉面积的50%均受到不同程度次生盐渍化的影响。土壤盐渍化抑制种子的萌发及作物的生长，使栽培作物的产量和品质下降[1]。土壤盐渍化这一古老的生态灾难再一次向人类发出了严峻警告[2]。

上世纪80 年代以来，我国在改造盐碱地，尤其在生物改良方面，各地均有许多成功的经验。如：内蒙古河套黄河灌区向日葵产区，羊草和碱茅是盐碱化草地上的优势植物，在松嫩平原上已得到应用推广。辽宁在重盐渍化地区栽培细叶藜，为养猪提供了优质青饲料。天津农科院耐盐水稻试验，中国农业大学在河北省曲周浅层咸水型盐碱化低产区进行了30 年的改良实验，使当地的农作物产量获得了很大的提高。利用盐生植物改造盐碱地的效果也比较明显，如东营盐生植物园。本文通过对盐胁迫下绿豆种子的发芽率、胚根长度及抗氧化酶活性的研究，旨在为植物的抗盐性提供科学依据。

已有研究表明，植物的耐盐性是由多基因控制的复合性状，并且是一系列的整体适应性，利用转基因技术提高植物抗盐性的研究已取得了一定的进展，某些植物的抗盐性得到了很大的提高[3]。在植物遭受生物和理化因子伤害时，膜上受体接受并传递胁迫信号，引发质膜和细胞器的氧化猝发产生ROS，ROS 在传送和放大信号的过程中会改变离子的分布和启动核基因的表达，从而使植物耐受各种胁迫。同时过氧化氢酶通过清除作用ROS 保持一定的浓度范围，过氧化氢酶的这种保护机制，也体现在植物各种抗逆反应中[4]。

植物在胁迫条件下，为了保护自身，能够产生许多抗性物质，从而抵御逆境的危害，以获得更好的生存环境。不同植物的抗氧化酶系统对盐胁迫的响应不同，虽然植物在受到胁迫时能够启动自身的酶系统来抵御不良环境，但也仅限于一定的胁迫范围内，当盐浓度过大时会对植物造成伤害，酶活性下降[5]。高昆等研究表明，不同浓度NaCl 处理锦灯笼后，其POD 活性随着NaCl 浓度的升高呈先升后降的趋势[6]。冯梅等研究表明，低浓度的盐胁迫可增强POD、CAT 活性，以此减弱体内有害物质CAT 的活性，随着盐浓度的增加，CAT 活性逐渐减弱[7]。陈忠祥在NaCl 胁迫对不同贮藏期罗布麻种子萌发及幼苗生理的影响中指出，随着NaCl 浓度增加，罗布麻幼苗期POD、CAT 酶活性均呈现先升后降的变化趋势[8]。然而系统研究盐浓度胁迫对绿豆种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶活性的影响报道甚少。本文以乌兰察布杂粮绿豆种子为材料，探讨不同盐浓度对其种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶活性的影响，筛选出最佳盐浓度，旨在为作物抗盐性提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 材料

试验所用绿豆购自乌兰察布市集宁区农贸市场。

2.2 方法

2.2.1 盐胁迫下绿豆种子的发芽率及胚根长度测定

（1）选取大小均匀的绿豆种子450 粒。每个培养皿中分别放入两层滤纸。取干净的15 个培养皿编号为1～15，其中1～3 号培养皿中倒入浓度为0.0 mmol/L 氯化钠溶液，4～6 号倒入浓度为100 mmol/L 氯化钠溶液，以此类推，每个处理重复3 次。每个培养皿放入30 粒绿豆种子，盖上纱布，注意保持纱布的湿润，放入恒温培养箱中。

（2）于1、3、5、7、9 天观察其发芽率并测量胚根长度。

2.2.2 抗氧化酶活性的测定

（1）抗氧化物酶粗酶液的提取

从上述各培养皿中随机挑选出绿豆，称取其样品重量加以记录，分别加入磷酸缓冲溶液（20 mmol/L，pH 值为6.0）研磨成匀浆状，定容至5 mL，于4000 r/min 离心15 min，上清液即为粗酶提取液。

（2）过氧化物酶活性的测定

采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性。具体为，吸取1 mL 提取液于试管中，加入3 mL 反应混合液（50 mL 磷酸缓冲溶液，加入愈创木酚28 μL，30%过氧化氢19 μL），以磷酸缓冲溶液为空白对照，立即测定每30 s（秒），470 nm 波长下光OD 值，共测2 min。

过氧化物酶活性（OD/g*FW）=[OD470 值/样品鲜重（g）]

（3）过氧化氢酶活性的测定

取上述各处理中的粗酶提取液0.2 mL 于试管中，加入2.8 mL 反应混合液（pH 值为7.8 磷酸缓冲溶液1.5 mL，加入100 mmol/L 30%过氧化氢0.3 L 和1 mL 蒸馏水），以蒸馏水为空白对照，立即测定每分钟240 nm 波长下光OD 值，共测4 min。

过氧化氢酶活性（µ/(g*FWmin)）=（ΔA240*Vt）/（W*Vs*0.01*t）

式中，Vt 为提取酶液总体积（mL）； W 为绿豆鲜重（g）； Vs 为测定时取用酶液体积（mL）；t 为反应时间（min）。

3 结果与分析

3.1 不同盐浓度胁迫对绿豆种子发芽率的影响

图1 为不同盐浓度胁迫对绿豆种子发芽率的影响。结果表明，处理浓度为0 mmol/L、100 mmol/L的条件下，各组内绿豆发芽率均为100%。处理浓度为200 mmol/L、300 mmol/L 条件下，各组内绿豆发芽率随培养时间延长，发芽率明显上升。盐浓度为200 mmol/L 处理条件下，第9 天种子发芽率

图1 不同盐浓度胁迫对绿豆种子发芽率的影响

虽有所下降，但方差分析结果显示，与对照无显著差异。同一处理天数不同浓度对绿豆种子萌发影响不同。与对照0 mmol/L 相比，100 mmol/L 处理与对照组无显著差异。当盐浓度为200 mmol/L 时，第1 天和第3 天绿豆种子发芽率显著低于同天对照，但5—7 天发芽率提高，与对照无显著差异。当盐浓度为300 mmol/L 和400 mmol/L 时，绿豆种子发芽率显著低于同天对照发芽率。

3.2 不同盐浓度胁迫对绿豆胚根长度的影响

图2 为不同盐浓度对绿豆种子胚根长度的影响。结果表明，同一盐浓度对绿豆种子发芽率影响不同，随着胚根生长天数增加。0 mmol/L 和100 mmol/L 盐浓度条件下，绿豆种子胚根长度显著增加。处理浓度为200 mmol/L 和300 mmol/L 盐胁迫条件下，胚根长度在第1、3、5 天不断增加，5天后长度基本不再增加。盐浓度为400 mmol/L 时，绿豆胚根基本不长。不同浓度同一时间，绿豆胚根长度变化不同。与对照相比，同一天中100 mmol/L 和200 mmol/L 处理均显著降低了胚根长度。

图2 不同盐浓度胁迫对绿豆胚根长度的影响

盐浓度大于300 mmol/L 时，胚根几乎不长。

3.3 不同盐浓度胁迫对绿豆抗氧化酶活性的影响

不同盐浓度对POD 活性的影响如图3。结果表明：当盐浓度在0～200 mmol/L 时，POD 均在处理第7 天达到最高，盐浓度为300～400 mmol/L 时，POD 活性在第3 天达到最高，但总体各时间点酶活性升高较慢。不同浓度同一天处理下，POD 活性在0 mmol/L、100 mmol/L 胁迫下变化趋势基本相同，当盐浓度为200 mmol/L 时，POD 活性变化变小。300 mmol/L 后基本无变化。

图3 不同盐浓度胁迫对绿豆过氧化物酶活性的影响

不同盐浓度对CAT 活性的影响如图4。结果表明：不同天数相同盐浓度中CAT 活性变化除400 mmol/L 外，其余浓度组内均呈波浪式下降上升，而处理浓度为400 mmol/L 条件下，过氧化氢酶活性组内呈先上升后下降趋势。在处理浓度为0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L 条件下胁迫3 天后，绿豆种子内过氧化氢酶活性与1 天相比下降，方差分析结果显示差异不显著；胁迫5 天，绿豆种子内过氧化氢酶活性与胁迫1 天相比显著升高。

图4 不同盐浓度胁迫对绿豆过氧化氢酶活性的影响

4 结论与讨论

与对照组相比，当盐浓度为100 mmol/L 时，种子发芽率与对照组相同，达到100%，胚根长度随培养天数延长而增加，但低于对照组。过氧化物酶活性在第7 天达到最高，过氧化氢酶活性在第5 天达到最高。当盐浓度达到200 mmol/L 时，与对照组相比，种子发芽率随培养天数增加而增长，低于对照组，最高为93.75%，胚根长度有所增加，但增长幅度很小，CAT 活性在5 天达到最高。当盐浓度达到300 mmol/L 时，发芽率随时间的延长而不断降低，最高仅为32.50%，CAT 活性在第5天达到最高。当盐浓度为400 mmol/L 时，种子基本不发芽，发芽率仅为1.25%，胚根生长停滞，CAT活性在第3 天达到最高，此后天数中逐渐降低。

王建科等研究得出，同种盐胁迫下随着盐浓度升高，种子萌发受到显著抑制[9]。刘顺平在研究不同浓度NaCl 处理对绿豆种子萌发的影响显示，种子在萌发过程中出芽阶段表现出较强的耐盐性，在50～200 mmol/L 的NaCl 盐胁迫下对其发芽率影响不明显，但显著抑制幼苗生长，随处理浓度的升高，其萌发、幼苗生长受到抑制的程度不断增大，绿豆种子萌发能忍耐的NaCl 处理浓度为200 mmol/L以下[10]。这与本实验基本一致。但王丽艳研究表明，除低浓度的NaCl（50 mmol/L）对绿豆种子萌发和幼苗的生长有一定的促进作用，所有种类所有浓度的盐胁迫对绿豆种子的萌发和幼苗的生长均有不同程度的抑制作用[11]。而本实验中绿豆可适应100 mmol/L NaCl 盐胁迫，这可能是由于试验所选用绿豆种子种类不同，也可能是由于50～100 mmol/L 间浓度变化不大，因而导致结果不同。刘微等在研究NaCl 胁迫对辣椒种子萌发及幼苗生长的影响表明，随着NaCl 浓度的升高，3 个辣椒品种的发芽率、胚根长度均呈现下降趋势，在萌发过程中辣椒种子仅可适应低于200 mmol/L NaCl 的盐胁迫[12]。这与本实验的研究结果具有一致性。但鉴于二者研究种类不同，因此绿豆种子萌发及幼苗生长所适应的胁迫浓度有待进一步研究。

本研究中，POD酶活性在100 mmol/L内，7天达到最高，CAT酶活性1天即达到最高。而李志萍研究得出，CAT活性在NaCl胁迫下呈现先降低后升高趋势，NaCl处理在400 mmol/L时达到最大值[13]。这与本研究略有不同，可能与试验品种有关，亦或是试验时测定CAT酶活性时间不同。周玉梅等用NaCl模拟盐害环境，研究苦豆子种子萌发过程中对盐胁迫响应的生理特性变化规律，得出低浓度的盐溶液引起POD与CAT活性极显著或显著上升，中度盐胁迫（100 mmol/L＜NaCl溶液≤200 mmol/L）下，POD活性显著下降，重度盐胁迫（NaCl溶液＞200 mmol/L）下，CAT酶活性显著上升，同时在重度盐胁迫下POD酶活性已降至最低值，只有CAT酶还保持比较高的活性[14]，这与本实验结果基本一致。宋玉伟等人研究发现绿豆幼苗随着盐胁迫浓度的增加和时间延长，POD、CAT的活性都呈上升趋势[15]。刘建霞等人研究发现，单盐胁迫处理使POD活性下降，明显低于对照组[16]。而本实验研究也表明，低浓度下POD活性随浓度增加和时间延长而升高，同时浓度为100 mmol/L下POD活性于第1天活性下降，此结果与宋玉伟、刘建霞的研究具有一致性。但本实验结果同时表明在浓度为200 mmol/L下，第3天CAT活性明显低于第1天，此结果因为两组结果时间不同而有待验证。

本研究结果表明，绿豆可适应的盐浓度为100 mmol/L，当盐浓度高于100 mmol/L时绿豆种子的发芽率逐渐降低，胚根长度生长随盐胁迫增加而生长缓慢，盐浓度大于300 mmol/L时胚根几乎不长。抗氧化酶如过氧化物酶、过氧化氢酶在盐胁迫中发挥重要作用，随盐浓度的升高，POD活性逐渐降低，但总体各时间点酶活性升高，速度较慢；CAT活性保持较高活性。本实验为作物抗盐性研究提供一定的理论依据，然而绿豆对盐胁迫响应的生理机制尚未明确，因此本研究在今后的实验中将通过代谢组学深入研究。