饮品中苯甲酸和山梨酸的检测

邬学清 高晓博 金 宏

（集宁师范学院 化学与化工学院，内蒙古 乌兰察布 012000）

1 引言

1.1 研究意义

目前，食品安全问题备受社会瞩目，而食品添加剂含量也是关注点。其中苯甲酸、山梨酸是食品中常用的添加剂和防腐剂[1]。苯甲酸是酸型食品防腐剂的一种，能抑制霉菌、酵母和细菌在酸性条件下的生长[2]。山梨酸也能抑制霉菌、酵母菌和好氧性细菌的生长活性，二者都能达到食品防腐目标，但是两者均不能食用过多和经常食用，否则会影响人体健康[3]。

根据资料，苯甲酸慢性中毒会导致头痛、晕眩、记忆力急剧下降、失眠、乏力、神经衰弱等症状；有的可能会导致体内免疫细胞数量降低，造成再生障碍性贫血[4]。一般认为，适量添加苯甲酸并不会在人体形成积累，是相对安全的。但是，苯甲酸能损坏细胞膜有序结构，使细胞膜的功能发生紊乱，干扰细胞内的各种平衡机制，使人体内各组织系统功能紊乱，出现呕吐、腹痛和心率变快等严重征状[5]，所以食品、饮品相对安全不可忽略；虽然山梨酸（钾）能够对霉菌、酵母菌和好氧性细菌的活性产生抑制作用，还能防止肉毒杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌等有害微生物的生长和繁殖[6]。但是经常食用含有过量山梨酸的饮品，在一定情况下会抑制骨骼生长，对肾脏和肝脏造成损伤[7]。目前已经将山梨酸列入国家食品安全检测项目。

饮品是以水为原料，用不同配方制作而成供人们经常饮用的液体食品，不同的成分饮料对人体有着不同的作用，有的以补充人体水分为主，有的以缓解人体疲劳为主，有的含有丰富的维生素，有的还具有抗疲劳作用[8]。它的制作原料有蔬菜、水果、乳品类等，商家为保障储存、运输会适当加入防腐剂和添加剂，由此市场饮品有可能存在安全隐患。苯甲酸和山梨酸是饮品生产一般防腐剂，GB2760-2008 中明确规定饮料类山梨酸最大使用量0.5 g/kg、苯甲酸最大使用1 g/kg[9]，可见对不同饮品苯甲酸和山梨酸的检测是食品安全检测的重要项目[8]。

1.2 研究现状及目的

如今，对于饮料中的苯甲酸和山梨酸含量的测定方法有多种，其中主要有高效液相色谱法和气相色谱法[9]。色谱法准确度高，但除了使用仪器价值高之外，还由于使用色谱柱填充料和流动相的特殊，使检测成本较高。梁奇峰教授等应用的比值倒数光度法，在不经分离的情况下，同时测得吸收光谱重叠严重的苯甲酸和山梨酸两组分的含量，此方法使用仪器简单，操作方便，广泛用于苯甲酸、山梨酸含量测定，但是数据处理复杂[10]。针对以上情况，对市场上不同饮品中的苯甲酸及山梨酸进行了抽样检测，一方面了解市场供应产品的质量安全指标，另一面为相关食品检测机构提供方便、经济、适用的检测方法。

1.3 研究思路及方法

苯甲酸具有芳烃结构，其吸收光谱在波长228 nm和272 nm处有K吸收带和B吸收带，且在非极性溶剂中B吸收带具有精细结构，随溶剂极性增大吸收带以一定的规律发生变化。山梨酸具有α、β不饱和羰基结构，在250 nm处有π跃迁的K吸收带[11]。综上所述，可以通过绘制物质溶液的紫外吸收光谱图，并在相同条件下与标准物光谱图进行比对，从而进行定性、定量分析。由于苯甲酸在水中溶解度小，而且容易升华；山梨酸难溶于水，所以本实验通过乙醚萃取和恒温蒸馏纯化饮品中的苯甲酸和山梨酸，在碱性条件下使其转化为可溶性的钠盐，利用紫外吸收分光光度法绘制它们的吸收光谱，确定最佳测定波长，利用分光光度法中的外标法定量测定苯甲酸和山梨酸的含量。

2 实验部分

2.1 主要仪器及试剂

756S 型紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司），FA2204B 电子天平（上海精密科学仪器有限公司），HH-2 数显恒温水浴锅（江苏金坛市荣华仪器制造有限公司），分液漏斗，蒸馏装置等仪器。

碳酸氢钠（分析纯），天津市化学制剂三厂；苯甲酸（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；山梨酸（化学纯），国药集团化学试剂有限公司；乙醚（分析纯），上海马陆制药厂；氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸钠（分析纯），天津市塘沽邓中化工厂。

2.2 溶液的配制

2%的NaHCO3配制：称取40 g NaHCO3溶解稀释到2000 mL 作为溶剂。

82.4 mg/L 苯甲酸标准储备液的配制：称取苯甲酸0.0206 g 于50 mL 烧杯中，以2% NaHCO3溶解转移至250 mL 容量瓶中准确定容，待用。

25.0 mg/L山梨酸标准储备液的配制：精确称取山梨酸0.0625 g置于50 mL烧杯中，以2%NaHCO3为溶解转移至250 mL 容量瓶中准确定容，为250 mg/L 标准储备液，再准确移取山梨酸标准储备液10mL 准确稀释到100 mL 待用。

苯甲酸系列标准溶液的配制：分别移取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL 的苯甲酸储备液于5 个50 mL 的容量瓶中，然后用2%的NaHCO3溶液定容至刻度，摇匀，静置，得到苯甲酸系列标准溶液（浓度间隔为1 mg/L）。

山梨酸标准系列溶液的配制：分别移取0.50 mL；1.00 mL；1.50 mL；2.00 mL；2.50 mL 的山梨酸储备液于5 个50 mL 的容量瓶中，然后用2%的NaHCO3溶液定容至刻度，摇匀，静置，得到山梨酸系列标准溶液（浓度间隔为0.5 mg/L）

苯甲酸-山梨酸的混合溶液的配制：移取苯甲酸B1(1.00 mL)；B2(2.00 mL)；B3(3.00 mL)；B4(4.00 mL)；B5（5.00 mL）至50 mL 容量瓶中，按照下表移取山梨酸S1(0.50 mL)；S2(1.00 mL)；S3(1.50 mL)；S4(2.00 mL)；S5(2.50 mL)至相应的50 mL 容量瓶中，用2%% NaHCO3定容至刻度，摇匀，作为标准混合系列溶液，待用。

2.3 样品的来源

随机购买商品饮料：怡泉柠檬味汽水（2018.8.17）可口可乐公司；浩明苏打水（2018.5.30）北京浩明品牌管理有限公司；可乐（2018.11.16）可口可乐公司；雪碧（2018.8.13）可口可乐公司；美年达（青苹果味2018.8.17）百事公司。

2.4 实验方法

2.4.1 样品中苯甲酸、山梨酸的提取

取2.3 中各样品20.00 mL，放于小烧杯中加入1mL 的HCl(6 mol/L)酸化，然后放置在250 mL分液漏斗中，依次用30 mL、20 mL、20 mL 的乙醚各萃取一次，每次萃取后都静置5 分钟。待分液漏斗中静置分层，将上层乙醚提取液转移到小烧杯中。合并3 次萃取液用5mL 的HCl 和NaCl 混合溶液洗涤，然后加入适量的无水硫酸钠用作吸收残余水份，搅拌，恒温加热到40℃，45 分钟后将其中残留乙醚蒸发出去，用2.0% NaHCO3 溶液溶解，移至100 mL 容量瓶中定容，待用。

表1 山梨酸苯甲酸混合系列溶液

2.4.2 样品中苯甲酸含量的检测

移取苯甲酸1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL 分别放置在5 个50 mL 的容量瓶，再分别依次准确滴加山梨酸1.00 mL，用2% NaHCO3定容。利用双波长分光光度法，在测定λ2 为230 nm；参比λ1 为276 nm 的条件下，绘制测定苯甲酸的标准曲线，线性方程为c=10.0695A-0.2677；相关系数r 为0.9995；线性范围为1.6 mg/L～8.0 mg/L；检出限量0.028 mg/L。准确移取2.4.1 中处理好的各样品提取液直接测量或稀释5 倍后测量其吸光度并计算其浓度。

2.4.3 样品中山梨酸含量的检测

移取山梨酸0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 分别放置在5 个50 mL 的容量瓶，再分别依次准确滴加苯甲酸3.00 mL，用2% NaHCO3定容。利用双波长分光光度法，在测定λ2 为255 nm；参比λ1 为276nm 的条件下，绘制测定山梨酸的标准曲线，线性方程为c=6.5135A+0.1726；相关系数r 为0.9999；线性范围为0.25 mg/L～5 mg/L；检出限量0.04 mg/L。准确移取2.4.1 中处理好的各样品提取液直接测量或稀释5 倍后测量其吸光度并算出其浓度。

3 结果与讨论

3.1 吸收光谱的绘制

用2% NaHCO3 溶液作为参比，分别测定苯甲酸、山梨酸系列标准溶液以及二者系列混合溶液的紫外吸收光谱（扫描范围为200～300 nm，波长间隔为1 nm，扫描速度为中速，扫描间隔为0.5 nm）。根据光谱图的峰值变化或光谱图比较确定苯甲酸、山梨酸的定量测定波长。具体见图1 至图9。

3.1.1 苯甲酸测定波长的确定

由图1、图2可知，随浓度的增大苯甲酸系列标准溶液的最大吸收波长有蓝移现象，而山梨酸的最大吸收波长随浓度增大无变化，苯甲酸的最大吸收波长225 nm处山梨酸有负吸收，在山梨酸的最大吸收波长255 nm处苯甲酸有正吸收，可见它们在最大吸收波长处都各有相互干扰，所以不能在它们最大吸收波长处进行分别测定。根据双波长分光光度法，吸收光谱相互重叠的两组份共存时可测定一种物质，而把另一种物质作为干扰物，所以在苯甲酸的测定波长处找山梨酸的等吸收波长。由图3可知，山梨酸在苯甲酸的最大吸收波长处有负吸收，难以确定等吸收波长；根据系数倍率法的原理也无法确定合适的参比波长[12]，而在苯甲酸吸收波长227 nm处有山梨酸的等波长点，但是随苯甲酸含量的变化，吸光度变化不均匀。由图2、图4、图5、图6可知，在230 nm处吸光度随苯甲酸浓度均匀变化，在276 nm处吸光度随山梨酸浓度的均匀变化而变化，因此苯甲酸测定可利用230 nm为测定波长，276为参比波长；以系列混合溶液绘制标准曲线进行苯甲酸含量测定。所有混合系列所得线性方程相关性很好，线性方程的斜率和截距相差不大，具体见表2。

3.1.2 山梨酸测定波长的确定

根据吸收光谱相互重叠的两组份共存时，双波长测定规则，测定山梨酸，把苯甲酸作为干扰；山梨酸的最大吸收波长处苯甲酸的等吸收波长有286 nm、225 nm，具体见图3。根据双波长选择规则，当两波长距离相近时，可认为背景吸收是相等[12]，待测组份吸收差最大。所以选择测定波长是255 nm，参比波长为286 nm，测定山梨酸系列溶液吸光度，并绘制标准曲线，显示线性方程相关性极差；由图7、图8、图9可知在255 nm处山梨酸的吸光度随均匀浓度变化。在276 nm处苯甲酸吸光度也随浓度均匀变化，因此，选择山梨酸的测定波长255 nm，参比波长276nm进行多组份混合液中山梨酸的测定，测定系列混合溶液吸光度，并分别绘制标准曲线，各线性方程的斜率、截距基本相同，相关系数符合分析测定一般要求，具体见表2。

表2 线性方程及相关系数的比较（X=1、2、3、4、5）

3.2 样品中苯甲酸、山梨酸的测定

用2.4.1的提取方法对五种样品各取两份提取处理后，用2.4.2、2.4.3苯甲酸和山梨酸的测定方法，对每一提取液各平行测定5次，同一样品的两份测定结果通过F、t检验都不存在显著性差异（95%的置信度），所以数据处理结果为两份提取液的平均值，利用合标准偏差进行精密度分析，即测定次数为10，自由度为8计算合标准偏差[13]；将B3+S3苯甲酸与山梨酸混合液在相应的线性方程下进行3次准确度测定，苯甲酸相对误差为+2.2%、山梨酸的误差是+9.3%（真值：苯甲酸4.94 mg/L山梨酸0.75 mg/L），结果见下表3。将各种饮料密度以1g/mL折算计算，五种饮料中防腐剂苯甲酸、山梨酸均无超标。测定方法供饮品质量检测参考使用或进一步验证。

表3 样品测定数据及结果分析