温差和水分对黄连生物碱合成基因表达的影响

李君君，刘林秋，文家维，陈涵婷，何 洋

(1.成都中医药大学 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137; 2.四川省肿瘤医院·研究所四川省癌症防治中心临床药学部，四川 成都 610041)

0 引 言

黄连Coptis chinensisFranch.为毛茛科黄连属，多年生草本植物，传统中药材，应用历史悠久，其主要药用部位为根茎[1]。现代研究表明，生物碱类化合物为其主要有效成分，包括小檗碱、黄连碱、巴马汀碱、药根碱、非洲防已碱以及表小檗碱，其中小檗碱含量最高[2]。生物碱类化合物大多具有优越的药理活性，现已证实具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和抗菌等药理作用[3-4]，具有较高的医用价值和经济价值。黄连在我国分布范围较广，四川、重庆、湖南、湖北以及陕西等地都有分布，但不同产地黄连的药用成分含量存在差异，其临床疗效也存在差异[5]。中药品质是种质遗传、生态环境及药材表型三者协调进化的结果，环境的变化也必然会导致遗传与表型的改变，由此造成药用成分含量及药用品质的改变，这也是药材品质差异区别所在[6]。因此，研究环境因子与遗传因素相互作用对解析生物碱生物合成分子机制具有关键作用。

目前关于环境因子调控黄连中生物碱合成途径关键基因表达的影响研究较少，对黄连的研究主要集中在化学成分分析、药理作用机制，以及转录组分析发现黄连质量形成关键基因[7-10]。此外，还有一些研究工作涉及到有效成分形成关键基因的克隆及其功能鉴定等方面[11-12]。通过我们前期进行的黄连潜在地理分布预测与化学成分分析，初步预测温差和降水为影响黄连潜在分布以及生长适宜性的关键环境因子[13]。在此基础上，本研究通过环境胁迫结合关键基因表达分析，通过实时荧光定量PCR[14]分析不同昼夜温差和水分下黄连生物碱合成途径关键基因表达的变化，以探究昼夜温差和水分缺失对黄连生物碱合成关键基因表达的影响，为进一步揭示生物碱合成的分子机制奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用的黄连植株（Coptis chinensisFranch.）材料来自于四川峨眉，选取长势良好的黄连植株进行采样。

1.2 昼夜温差处理

选取生长状况及规格一致的黄连植株分为A、B、C、D 4组，每组3株。D组为对照组，将其放入生化培养箱中，温度设置为 22 ℃。A、B、C 3组为实验组，在 0～7 d 期间培养箱温度设置为 22 ℃，在8～14 d 设定培养箱温度为 22 ℃（昼）/12 ℃（夜），15～21 d培养温度为 22 ℃[15-17]，培养期间 A、B、C、D 4 组光照时间均为 12 h，光照强度为 3 000 lx。分别于第 7 d、14 d、21 d 各收集 4 组黄连样品中一株植株，采集其根茎叶组织，用75%乙醇对收集组织样品进行消毒，用无菌水冲洗祛除残余乙醇，将处理好的组织样品存放于液氮中，用于后续RNA提取。

1.3 水分胁迫处理

选择生长状况及规格一致的黄连植物分为A、B、C、D 4组，每组3株。D组为对照组，整个试验期间每两天浇一次水，使土壤水分含量维持在55%～65%；A、B、C 3组为实验组，0～7 d每两天浇一次水，8～14 d停止浇水，土壤水分含量维持在35%～45%，15～21 d恢复浇水，定期测定各组土壤水分含量以确定浇水量，培养期间光照时间均为12 h，光照强度为 3 000 lx，分别于第 7 d、14 d、21 d 各收集4组黄连样品中一株植株，采集其根茎叶组织[18-19]，收集的组织样品处理方法同1.2。

1.4 关键基因选择

根据已有文献[20-21]以及课题组前期进行的黄连基因组测序和黄连有效成分代谢通路构建工作，选择黄连小檗碱下游生物合成途径中的关键基因，包括可催化亚甲基二氧桥的形成的Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1，以及参与黄连多种生物碱合成途径，可催化四氢化合物氧化的Cchi078208.m1和Cchi013467.m1，以黄连 18S rRNA（Genebank Accession No.DQ406855）为内参，采用SYBR Green方法进行实时qRT-PCR，分析关键环境因子胁迫条件下其表达水平变化。

1.5 总RNA提取及cDNA合成

采用天根植物总RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant Kit，目录号：DP432），按照说明书提取黄连根、茎、叶样品总RNA。RNA提取后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，经微量分光光度计检测其纯度和浓度，以检测合格的总RNA为模板，采用TransScript® First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行cDNA扩增。

1.6 荧光定量PCR

根据前期课题组黄连基因组测序得到目的基因序列，利用Prime 5.0设计PCR引物（表1）。采用全式金 TransStart® Green qPCR SuperMix 试剂盒进行qRT-PCR，反应体系见表2。荧光定量采取三步法反应程序，94 ℃ 变性 30 s；94 ℃ 反应 5 s，退火15 s，72 ℃ 反应 10 s，循环 40 次，收集荧光信号，并在循环结束后进行溶解曲线分析。每个样品均进行三次重复。相对定量法分析实验结果，计算2-ΔΔCt值。利用 Excel 2019 整理原始数据，GraphPad Prism 7.0 绘制图形。

表2 荧光定量PCR反应体系

2 结果与分析

2.1 昼夜温差和水分缺失对黄连表型的影响

黄连适宜分布于温带湿润季风气候地区，为其生长提供寒冷、湿润和阴暗的环境条件，其生长的温度范围为 5～34 ℃，适宜生长温度为 15～22 ℃[22]。已有研究表明温度上下波动10 ℃足以对黄连产生伤害，并且黄连对高温变化更为敏感[23]，具有耐低温不耐高温的习性，本文以黄连正常适宜温度为基础，最大化研究温差对黄连生物碱合成基因表达的影响，将温差控制在12～22 ℃。昼夜温差和水分缺失对黄连表型的影响结果见图1。如图所示，在昼夜温差 22 ℃（昼）/12 ℃（夜）处理后，部分黄连植株的叶片发生了不同程度的黄化，黄化的叶片呈淡绿色或淡黄色，黄化程度不高。黄连喜阴，更易在潮湿的环境中生长，水分缺失对黄连生长的影响较大，结果显示，水分缺失处理之后，大部分黄连植株的叶片均发生了黄化，部分叶片的黄化程度较高，叶片呈深黄色或浅褐色，显焦褐状。

图1 昼夜温差（A）和水分缺失（B）条件下的黄连

2.2 荧光定量检测体系的建立

本研究使用耶拿荧光定量仪进行PCR反应。采用相对定量的方法检测黄连生物碱生物合成途径中 6个关键基因Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1、Cchi047990.m1、Cchi078208.m1和Cchi013467.m1，在不同胁迫条件下不同时间点黄连各部位的表达水平。黄连18S rRNA为内参基因，以未经胁迫处理，正常生长的黄连作为对照样品。图2为6对引物的溶解曲线，均为单峰，除目的基因外，无非特异性扩增，特异性较好，并且溶解温度均在80 ℃左右，符合实验要求。

图2 引物溶解曲线图

2.3 基因表达结果

对黄连生物碱生物合成途径中具有重要功能的6个关键基因进行qRT-PCR分析，不同胁迫条件下不同时间点黄连各部位基因表达水平变化，以未经胁迫处理的黄连作为对照样品，采用相对定量法分析实验结果，计算2-ΔΔCt值，进行统计分析。

图3为温差胁迫条件下黄连根（图3A）、茎（图3B）以及叶（图3C）中各目的基因的表达情况，温差胁迫以及正常处理条件下各目的基因在黄连不同组织部位的表达趋势一致，表现为其表达量会随着时间的推移而增加，说明黄连不同部位受温差胁迫的影响一致。在温差胁迫处理后，即14 d时，A、B、C 3个实验组中黄连不同组织部位目的基因的表达量高于对照组，这说明昼夜温差对黄连生物碱合成关键基因表达具有诱导作用，可对黄连生物碱合成进行正向调控，推测昼夜温差可能通过诱导这关键基因表达而使小檗碱的合成和积累增加。

图3 黄连温差处理条件下根（A）、茎（B）、叶（C）中目的基因的相对表达量

图4为水分胁迫下黄连根（图4A）、茎（图4B）以及叶（图4C）中各目的基因的表达情况，结果如图所示，水分缺失以及正常水分处理条件下各目的基因在黄连不同组织部位中的表达趋势一致，这与温差胁迫处理的结果类似。但与温差处理条件下不同的是，在经过水分缺失处理后，Cchi078208.m1和Cchi013467.m1基因表达量均高于正常浇水情况，在恢复浇水之后，其表达量反而减少，水分缺失对这两个关键基因表达具有诱导作用。而目的基因Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1在黄连不同组织部位中其表达量均随着时间的推移增加，但在经过水分缺失处理后其表达量均显著低于对照组。说明水分的缺失会增加催化四氢氧化物氧化的关键基因的表达量而使黄连有效成分的合成和积累增加，使催化亚甲基二氧桥关键基因的表达量降低而影响其小檗碱形成。

图4 黄连水分缺失条件下根（A）、茎（B）、叶（C）中目的基因的相对表达量

3 结束语

本文通过昼夜温差以及水分对黄连进行胁迫处理，利用qRT-PCR对经过胁迫处理后的黄连样品以及对照黄连样品中关键基因的表达进行分析，分析关键环境因子对关键基因表达水平的影响。实验结果显示，在胁迫条件处理后，黄连各部位中关键基因的表达趋势一致。昼夜温差处理对关键基因具有直接特异诱导的作用，而水分的缺失可能会增加Cchi078208.m1和Cchi013467.m1的表达量，会使Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1的表达量降低。黄连中有效成分的形成经多基因调控，关键环境因子对其生物碱生物合成途径中关键基因具有不同的调控作用，从而影响黄连质量形成，导致不同产地黄连药材质量差异。