利用宏基因组高通量测序技术揭示血液病患者的感染谱

庞如利，吴梅青，石泽延，林雨，粟燕云，周宝文，白子文，赵卫华

感染是血液病患者常见的并发症和死亡原因，研究发现引起血液病患者感染的原因一方面是由于患者接受化疗等治疗引起中性粒细胞减少，另一方面是由于多种侵入性操作和输血等[1-3]。因此，早期检测引起感染的病原微生物对改善血液病患者的预后尤为重要。传统的病原微生物检测方法，以培养法为代表，培养周期过长、且容易受抗生素的影响，不利于临床快速诊断和治疗[4]。随着检测技术的进步，近年来出现的宏基因组高通量测序（mNGs）技术在临床中得到越来越多的应用。mNGs技术具有操作简单、所需样本量小、检测快、不易受污染、可检测出培养法不能检测的边缘微生物的优点[4]。本研究回顾性分析2018年8月至2020年12月广西医科大学第一附属医院血液科利用mNGs技术检测有或疑似有感染症状患者的数据，明确患者的感染谱，以探讨该技术在血液病患者感染的早期诊断及治疗中的意义。

本研究主要发现：

（1）本研究利用宏基因组高通量测序（mNGs）技术揭示了血液学患者的感染谱，革兰阳性菌中最常见的为痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌，革兰阴性菌中最常见的为约翰逊不动杆菌、越南伯克霍尔德菌、乌汶克霍尔德菌，真菌中最常见的为限制性马拉色菌；病毒中最常见的为巨细胞病毒、EB病毒、细环病毒。（2）mNGs技术与其他传统检测方法相比，具有高敏感性，可检出更多病原体，且检测时间快，对临床尽早确定感染病因，调整用药方案具有重要参考意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本来源于2018年8月至2020年12月广西医科大学第一附属医院血液科住院期间出现感染或疑似感染症状的53例血液病患者，对53例患者的58个样本（全血、脑脊液、胸腔积液、组织、腹腔引流液、关节液、痰液、右下肢穿刺液）进行mNGs技术检测。样本送检前有50个样本的患者（包括45例患者，其中5例患者在不同的时间段送检2次）有不同程度的发热，伴随症状有头晕、头痛、嗜睡、咳嗽、咳痰、咽痛、胸闷、胸痛、气促等，其中进行影像学检查的45个样本中出现胸部、腹部或脑部影像学改变有34个（包括32例患者，其中2例患者在不同的时间段送检2次）；8个样本的患者（8例患者）无发热，其中7个样本的患者仅表现为胸闷、气促、抽搐等疑似感染症状，1个样本的患者无明显症状，有7例患者出现胸部、脑部或关节影像学改变。此外，标本送检前54个样本的患者采用经验性抗菌、抗真菌或抗病毒药物治疗1～69 d，相关报道指出mNGs技术检测结果受抗生素的影响较小[5]。

1.2 方法

1.2.1 mNGs技术 采用3种mNGs技术检测方法，分别为PMseqTM、PDC-seqTM、IDseqTM 。3种方法基于高通量测序技术对样本中微生物核酸序列进行分析，通过与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对鉴定微生物。检测过程：不同标本分别冷链送至华大基因公司（49个标本）、杰毅基因公司（5个标本）、微远基因公司（4个标本）。对送检的样本进行处理、提取核酸（DNA和/或RNA）。对于核酸含量符合要求的样本分别进行PMseqTM文库构建、PDC-seqTM文库构建、IDseqTM文库构建，然后进行mNGs，去除测序的接头及低质量和低复杂区域的序列后，利用计算宿主减法滤过人类基因组数据[6]，将处理后的非人类测序读数与所构建的文库进行匹配，最后取得可疑致病微生物的种类及相对丰度信息，从标本送检至结果报告仅需2～3个工作日。

1.2.2 其他方法 在进行mNGs技术检测的同时，52例患者（55个样本）采用培养法检测致病微生物、46例患者（50个样本）采用G/GM试验检测致病微生物、44例患者（48个样本）采用PCR检测致病微生物。

1.3 统计学方法 采用sPss 26.0软件进行数据分析。计数资料以相对数表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者资料及送检情况 53例患者中男36例，女17例；年龄4～67岁，中位年龄18岁；重型地中海贫血23例，白血病17例，淋巴瘤4例，多发性骨髓瘤3例，地中海贫血合并白血病1例，重型再生障碍性贫血1例，骨髓增生异常综合征1例，白细胞、血小板计数升高查因1例，全血细胞减少查因1例，发热查因1例。53例患者中有5例患者送检2次，其中在8个月内、4个月内、2个月内送检2次的各有1例，在1个月内送检2次的有2例。所送检的58个样本类型为全血（42个）、脑脊液（4个）、胸腔积液（4个）、组织（3个）、腹腔引流液（1个）、关节液（1个）、痰液（1个）、右下肢穿刺液（1个）。送检前白细胞计数：33个样本＜4×109/L，19个样本为（4～10）×109/L，6个样本＞10×109/L；送检前中性粒细胞计数：16个样本＜0.5×109/L，10个样本为（0.5～2.0）×109/L，32个样本 ＞2.0×109/L。

2.2 mNGs技术检测血液病患者的感染谱 对58个样本进行mNGs，57个样本检出可疑病原体（占98.3%），1个样本无病原体检出，且其他检测方法亦为阴性，所检测样本的结果见图1。

图1 mNGs技术检测的血液病患者的感染谱Figure 1 Bacterial and viral pathogen spectra of infections in patients with hematological diseases detected by use of mNGs technology

2.2.1 细菌感染谱 共检测出革兰阳性菌153例次，含25种细菌，前3位分别为痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌（分别为42、33、32例次，平均序列分别为187、117、240），见表1。共检测出革兰阴性菌202例次，含47种细菌，常见的为约翰逊不动杆菌、越南伯克霍尔德菌、乌汶克霍尔德菌（分别为26、20、19例次，平均序列分别为249、4 582、238），见表2。

表1 测序阳性的革兰阳性菌分布情况〔n（%）〕Table 1 The distribution of Gram-positive bacteria detected by use of mNGs technology

表2 测序阳性的革兰阴性菌分布〔n（%）〕Table 2 The distribution of Gram-negative bacteria detected by use of mNGs technology

2.2.2 真菌感染谱 共检出真菌40例次，含12种真菌，其中以限制性马拉色菌最常见（28例次，平均序列为69），见表3。

表3 测序阳性真菌分布 〔n（%）〕Table 3 The distribution of fungi species detected by use of mNGs technology

2.2.3 病毒感染谱 病毒检测范围仅限于常见DNA病毒，共检出病毒97例次，含22种病毒，其中常见的为巨细胞病毒（CMV）、各型细环病毒、EB病毒（分别为26、19、13例次，平均序列分别为595、23、307），见表4。其他病原微生物感染谱：1例重型地中海贫血造血干细胞移植后患者血液及脑脊液样本中均检出刚地弓形虫（序列分别为151、34 183）。

表4 测序阳性病毒种类分布〔n（%）〕Table 4 The distribution of viral species detected by use of mNGs technology

2.3 mNGs技术与其他检测方法的检测结果比较及指导治疗情况 选择同时进行mNGs技术检测、培养法、G/GM试验、PCR检测的38个样本进行分析。mNGs技术与培养法、G/GM试验、PCR检测病原微生物阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=64.504，P＜0.001）；mNGs技术检测病原微生物阳性率高于培养法、G/GM试验、PCR检测，差异有统计学意义（χ2=44.333、P＜0.001，χ2=37.255、P＜0.001，χ2=52.356、P＜0.001），见表5。mNGs技术与其他检测方法同时检测出相同病原微生物的有14个样本，样本阳性一致率为36.8%，检出的相同病原微生物为CMV、EB病毒、嗜麦芽窄食单胞菌、限制性马拉色菌、曲霉菌属、白色念珠菌、阿萨西毛孢子菌。mNGs技术未检出相关病原微生物但其他检测方法检出的样本数为8个，概率为21.0%，相关病原微生物包括嗜麦芽窄食单胞菌、EB病毒、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌。此外，根据mNGs技术检测结果调整用药的有6例患者，其中4例患者经治疗好转，2例患者治疗效果欠佳，治疗效果欠佳患者系多重感染且免疫力低下，见表6。达70%[11]。以上研究说明血液病患者极易发生感染，及时检测出引发感染的病原微生物对于正确使用抗感染药物、快速控制感染及降低血液病患者死亡率具有重要

表5 mNGs技术与其他检测方法的检测结果比较Table 5 Detection results by use of mNGs technology and other three test methods

表6 根据mNGs技术检测结果调整用药情况Table 6 Medications adjusted for seven patients by the mNGs technology detection results

3 讨论

恶性血液病患者由于受原发病的影响，免疫力低，传统的化疗药物会导致其免疫力进一步受到影响，感染风险增加[7]。虽然近年来免疫抑制剂和小分子靶向药物的使用改变了血液病患者的治疗前景，但其与患者潜在的感染风险关系密切[8]。研究表明，感染是超过60%的血液系统恶性肿瘤患者的死亡原因，病原微生物感染所占比重从高到低依次为细菌感染、真菌感染、病毒感染[9]。有研究指出血液病患者和肿瘤患者血流感染的总死亡率为12.3%[10]。此外，也有研究表明血流感染是肿瘤患者30 d内死亡的影响因素，其死亡率为22%，若不能得到及时有效的抗感染治疗，死亡率可高意义。传统的病原微生物检测方法虽然技术成熟，但存在检测的病原微生物谱窄、不可检测特殊病原微生物、花费时间长的局限，二代测序技术很好地弥补了传统病原微生物检测技术的缺点，其向临床报告结果仅需2～3个工作日。本研究利用mNGs技术揭示了血液病患者的感染谱，下面就该感染谱的部分病原微生物展开讨论。

既往研究表明，恶性血液病患者院内感染最常见的部位是呼吸道，最常见的病原菌是革兰阴性菌[12-13]。本研究的细菌感染谱结果与上述结论一致，检出的病原菌也以革兰性阴性菌居多，但具体病原菌不尽相同，这主要归因于检测方法的不同，mNGs技术的检测敏感性高，可检测更多的机会性致病菌。本研究检出的革兰阳性菌中常见的葡萄球菌为表皮葡萄球菌和人葡萄球菌，均为机会性致病菌，人体免疫力下降时机会性致病葡萄球菌可能会引起感染症状。此外，由于近年来抗生素的广泛使用，葡萄球菌多重耐药有上升趋势，一项研究指出人葡萄球菌及表皮葡萄球菌对青霉素耐药率较高，分别为68.0%及90.9%[14]。故血液病患者出现感染症状并伴有葡萄球菌感染时，需根据临床情况及时排查感染因素，谨慎处理。

本研究真菌感染谱中检出率最高的为限制性马拉色菌。限制性马拉色菌是健康人皮肤的常驻优势真菌[15]，也是一种条件致病菌。此外，本研究共检出霉菌和酵母菌6例次（占15%），一项关于血液病患者真菌感染的研究显示，血液病患者感染霉菌和酵母菌后的死亡率分别为70%和39%[16]，提示早期检测出感染菌种有利于治疗效果及预后。

一项对血液病患者造血干细胞移植后感染谱的研究显示，病毒感染谱中检出率最高的依次为CMV、EB病毒、细环病毒[17]。本研究病毒感染谱与之基本一致。另有研究显示血液病患者发生CMV、EB病毒感染的风险高，且二者感染可降低患者免疫力，进一步加重感染风险[18]。此外，有研究指出细环病毒是免疫力的潜在标志物，可作为免疫力评估的补充[19-20]。

有研究表明中枢神经系统感染是血液病患者造血干细胞移植后的主要并发症，弓形虫感染是其主要病因[19-20]。而本研究中利用mNGs技术检测1例重型地中海贫血造血干细胞移植后患者血液及脑脊液样本中均发现刚地弓形虫感染，为其治疗方案提供了不可或缺的证据。

此前有研究指出mNGs技术比传统培养法检测阳性率更高，敏感性更高[21]，本研究结果与之一致。本研究利用mNGs技术对血液病患者样本的检测阳性率为98.3%，远高于使用其他检测方法（培养法、G/GM试验、PCR检测）的阳性率。mNGs技术的高敏感性对于血液病患者感染病因的寻找更加有利。但由于此法的高敏感性，样本的污染菌也会被一并检测出，故检测结果会混淆临床医生对感染病因的准确判断。只有在各个流程尽量避免样本污染方可避免。此外，mNGs技术具有操作简单、所需样本量小、检测快的优点，可使临床工作者在最短时间内确定血液病患者感染病因，合理使用药物控制感染，降低患者死亡率和改善患者预后，这与本研究根据mNGs技术检测结果调整用药的患者大多可控制感染的情况一致。本研究结果显示，在同时进行4种检测方法的38样本中，mNGs技术未检出相关病原菌但其他检测方法检出的样本数为8个，说明mNGs技术有一定的假阴性率，故在进行mNGs技术检测的同时，应同时进行培养法、G/GM试验、PCR检测以增加查找感染病因的准确度。本研究检出的结果与全国多中心细菌培养结果不一致，主要归因于本研究所用检测方法的不同且患者数量有限。

综上所述，mNGs技术比其他检测技术对血液病患者感染病因的确定更具有优势，但其可能出现假阳性和假阴性，结合其他检测方法可降低错误诊断的机会。

作者贡献：庞如利进行文章的构思和研究设计，结果的分析与解释，负责撰写论文；庞如利、赵卫华对文章整体负责，监督管理；吴梅青、石泽延、林雨负责资料收集与整理；粟燕云、周宝文、白子文负责数据处理与统计学分析、论文修订与校正；赵卫华进行研究的实施与可行性分析，负责文章的质量控制。

本文无利益冲突。