单中心视神经萎缩患者突变基因和临床表型多样性研究

徐歆桐，白文浩，孙明明，陈希赟，徐全刚，魏世辉，周欢粉

1 解放军医学院，北京 100853；2 解放军总医院第三医学中心 眼科医学部，北京 100853

遗传性视神经病变(inherited optic neuropathy，ION)是一种罕见的、具有多种遗传方式、导致严重视功能丧失的疾病；其遗传方式包括常染色体显性遗传、线粒体及常染色体隐性遗传等[1-2]；ION患者青少年期双眼发病多见，可表现为孤立性视神经萎缩，也可伴有全身及多种神经系统症状，表现为综合征型，伴有听力异常、共济失调、运动肌肉异常等[3-4]。ION的诊断需要结合患者的临床表现、眼科检查及基因诊断。家族史、病史、瞳孔、视野、眼底、光学相干断层扫描技术(optical coherence tomography，OCT)、荧光素眼底血管造影等是本病诊断的重要依据。同时对ION患者家庭成员进行基因检测也是非常必要的。国内尚未普遍开展基因检测技术，ION引起的视力下降常被误诊为视神经炎、缺血性视神经病变或归类为不明原因视神经萎缩；因此了解ION的遗传规律、熟悉致病基因的突变谱及变异特征，对诊断ION至关重要。近年来，随着分子生物学技术的发展，二代测序技术不仅能同时对大量候选核基因甚至全外显子进行平行测序，还可发现新的致病基因[5]。本文将分析单中心不明原因视神经萎缩患者遗传相关致病基因特征，研究其基因突变形式与临床表型之间的关系，为临床可疑病例确诊、指导疾病治疗、患儿家属遗传咨询等提供理论依据，进一步提高神经眼科医师对这一相对罕见疾病的认识，从而充分发挥基因检测的应用价值。

资料与方法

1 一般资料 纳入2017年1月1日- 2021年8月31日解放军总医院眼科诊断为视神经萎缩的患者及部分患者家属。本研究已获得解放军总医院临床研究伦理委员会许可(S2019-111-01)。入组标准：1) 单眼或双眼视力下降；2) 至少合并下列两项异常——色觉障碍、视野异常、视觉诱发电位异常，OCT示视盘周边神经纤维层薄变或黄斑区节细胞薄变；3) 在征得患者及患者家属的意见后，签署知情同意书。排除标准：1) 其他疾病导致的视神经萎缩，如青光眼、炎性脱髓鞘、缺血、感染、中毒、外伤、颅内病变等[3]；2) 其他眼病导致视力下降患者，白内障、糖尿病视网膜病变、黄斑病变、视网膜中央或分支动脉阻塞、视网膜中央或分支静脉阻塞等。

2 基因检测 采集外周静脉血5 mL进行遗传分子检测，使用QIAamp全血DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取DNA。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术扩增目的基因片段，用SPRI beads(美国Beckman Coulter)纯化PCR产物，将最终纯化的PCR扩增产物用HiSeq 2000第二代测序仪进行双端测序。测序结果与HGMD数据库(www.HGMD.org)和Mitomap数据库(www.mitomap.org)进行对比。

3 研究方法 分析视神经萎缩患者中线粒体基因(mitochondrial DNA，mtDNA)突变相关疾病临床表型特征和基因突变分布，以及核基因(nuclear DNA，nDNA)突变的显性遗传性视神经萎缩(dominant optic atrophy，DOA)患者和非DOA患者基因突变分布。

结 果

1 患者基本特征 共纳入479例视神经萎缩患者，男性占77.2%(370/479)，男女比例为3.4∶1。其中260例检测出突变基因，阳性检出率为54.3%(260/479)，基因突变患者临床症状和基因检测结果相符，明确诊断为ION；其中51.5%(134/260)年龄＜18岁；42.3%(110/260)18 ～ 45岁；6.2%(16/260)＞45岁。260例ION患者中，209例检测出28种mtDNA致病突变，占所有突变患者的80.4%(209/260)；51例检出15种nDNA突变，占19.6%(51/260)。见表1。

表1 479例视神经萎缩患者基本特征Tab. 1 Characteristics of 479 patients with optic atrophy

2 mtDNA突变患者特征分析 1) mtDNA突变患者临床表型：在mtDNA突变基因患者中，97.6%(204/209)诊断为Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)，3例Leigh综合征，1例MELAS综合征(图1)，1例MERRF综合征。疾病类型详见图2。2) mtDNA突变位点分布：在LHON患者中，32.3%(66/204)有家族史。76.5%(156/204)患者携带常见突变位点：56.8%(116/204)携带m.11778G ＞ A，15.7%(32/204)携带m.14484T ＞ C，3.9%(36/204)携带m.3460G＞A。17.6%(36/204)携带罕见位点突变，其中m.14502 T ＞ C和m.11696A ＞ G分别占5.4%(11/204)和3.4%(7/204)，其余罕见突变占8.3%(17/204)。5.9%(12/204)患者同时携带两个突变位点，其中6例为m.11778G ＞ A同时合并其他继发位点突变(4例m.11778G ＞ A/m.14502T ＞ C，1例m.11778G ＞A/m.14568 C ＞ T，1例m.11778G ＞ A/m.11696A ＞G)，2例为m.14484T ＞ C合并其他位点突变(1例m.14484T ＞ C/m.11696A ＞ G、1例m.14484T ＞ C/m.14502T ＞ C)(表2。另外，在5例其他mtDNA突变引起的视神经萎缩患者中，3例Leigh综合征为m.13513G ＞ A突变，1例MELAS综合征为m.12264C ＞ T(图2)，1例MERRF综合征为m.13042G ＞ A突变。目前已知LHON突变位点50余种(www.mitomap.org)，与数据库结果对比发现，本研究检测结果中25种mtDNA突变位点已被文献明确报道与LHON相关，其余3种与线粒

图1 患者女性，31岁，因“双眼逐渐视力下降1年”入院，既往全身活动度减低，双耳重度神经性耳聋，曾出现休克症状。辅助检查，双眼眼底照(A、B)：双眼视盘苍白、界清，视网膜动脉白线状改变，静脉略变细，视网膜整体色晦暗，多量色素萎缩及色素斑可见；视盘OCT(C)：双眼视盘周围视网膜神经纤维层变薄；黄斑OCT(D)：双眼黄斑区神经节细胞层变薄；基因检测结果：mtDNA12264 C＞T；乳酸3.14 mmol/L；头颅MRI：双侧基底节、丘脑可见对称性短T1信号。该患者诊断为“MELAS综合征”Fig.1 A 31-year-old female patient was admitted to the hospital due to "gradual vision loss in both eyes for 1 year". She had previously decreased systemic activity, severe neurological deafness and had symptoms of shock. Examinations: Fundus photographs (A, B): The optic discs of both eyes were pale and clear, with white linear changes of retinal arteries and thinner vein, the color of retinal was dull, and multiple pigmented atrophy and spots were visible; Optic disc OCT (C): The retinal nerve fiber layer around the optic disc were thinning in both eyes; Macular OCT (D): Macular ganglion cell layer in both eyes were thinning; Genetic test results: mtDNA12264 C ＞ T; Lactic acid: 3.14 mmol/L; MRI of head: The short T1 signal was seen in bilateral basal ganglia and thalamus.The patient was diagnosed with "MELAS syndrome"

图2 260例ION患者疾病表型分布Fig.2 The distribution of disease phenotypes in 260 patients with IONION: inherited optic neuropathy; LHON: Leber hereditary optic neuropathy; DOA: dominant optic atrophy; CPEO:chronic progressive external ophthalmoplegia

体脑肌病相关(表2)。

表2 28种线粒体突变基因位点Tab. 2 28 types of mitochondrial gene mutation

3 nDNA突变患者特征分析 1) DOA患者基因突变分布：58.8%(30/51)nDNA突变患者检出与DOA相关的突变基因，其中24例患者为OPA1基因突变，4例OPA3基因突变，2例为OPA1合并其他基因突变(1例OPA1/OPA3，1例OPA1/WFS1)，但都表现为DOA的症状。在OPA1基因突变的患者中，5例患者有家族史。所有OPA1变异的样本中包括5个转录本(NM_006005、NM_015560，NM_130831、NM_130835、NM_130837)，16种外显子，其中外显子10为OPA1基因突变的高发区域(表3)。2) 非DOA患者基因突变分布：在21例非DOA引起的视神经萎缩nDNA突变患者中，检测出5例Wolfram综合征患者与WFS1突变相关，3例慢性进行性眼外肌麻痹患者与RRM2B相关。另外13例患者合并其他少见视神经萎缩相关的突变基因，如1例轴突型腓骨肌萎缩症2A2A患者视神经萎缩与MFN2突变相关，1例与Short综合征、视神经萎缩和Pelger-Huët异常有关的NBAS突变，其他与视神经萎缩相关的nDNA突变详见表4。

表3 OPA1基因突变外显子Tab. 3 OPA1 gene mutation in exon

表4 17种核基因突变Tab. 4 17 types of nuclear gene mutation

讨 论

视神经萎缩是神经眼科疾病中常见的一种临床特征。视神经萎缩通常发生在疾病过程的最后阶段，临床表现为不同程度的视力下降，非特异的视盘苍白，视神经纤维层薄变。导致视神经萎缩的相关因素可大致分为血管性、炎性或感染性、肿瘤性或压迫性、原发性脱髓鞘疾病或特发性视神经炎、中毒性、外伤性、先天性或遗传性、代谢性、退行性等[2,6-7]。马来西亚的一项研究发现，非青光眼性视神经萎缩主要病因是占位性颅内病变(26%)、先天性或遗传性疾病(13%)、脑积水(12%)、创伤(12%)和血管性疾病(12%)[2]。由此可见，先天性或遗传性疾病是引起视神经萎缩的重要原因，此类患者发病年龄较轻，双眼发病，视力损伤严重。

我国人口基数大，ION罹病者也较多。目前已知OPA1基因突变与DOA高度相关，m.3460G ＞A、m.11778G ＞ A、m.14484T ＞ C等 mtDNA位点突变与LHON相关[8-10]。但对于其他引起视神经萎缩相关的突变基因我国尚缺乏系统性的研究。本研究共采集了479例视神经萎缩患者样本进行遗传分子检测，ION基因突变阳性检出率为54.3%(260/479)。法国的一项ION的分子筛查中纳入983例患者，其45%基因突变阳性率略低于本研究结果[8]。

LHON为线粒体母系遗传病，但其发病亦受到nDNA、线粒体遗传背景和环境因素的共同影响。河北邢台地区的LHON发病率估计最低为1.09/100 000，与全国的估计发病率(1/100 000)相近。目前暂无其他亚洲人群的流行病学资料。英格兰东北部成年人患病率估计最低为3.22/100 000，携带者为11.82/100 000[11]。随着基因测序技术的发展，越来越多的致病突变位点逐渐被发现。本研究中LHON基因突变引起的视神经萎缩占42.6%(204/479)。与Ferré等[8]研究显示LHON患者mtDNA突变引起的视神经萎缩仅占13%结果相差较大，而与我国曾报道LHON相关的视神经萎缩致病检出率为47.5%结果相当[12]。我们分析可能是由于种族和纳入诊断标准不一致所引起。

本研究LHON患者中，常见位点突变占76.5%(156/204)，低于Ferré等[8]报道的95%，而与谢玥等[12]报道的85%接近。 LHON相关突变及其发病率在不同种族背景人群中有所不同，导致国内外研究结果可能会存在差异。罕见突变位点中最常见的为m.14502T＞C和m.11696A ＞ G，也与国外研究中的结论不同。值得注意的是，研究报道m.14502T ＞ C突变被证明是LHON的表型修饰剂而非致病位点，通常会伴随原发位点突变而加重线粒体代谢功能障碍[13]。但本研究中17例检测出m.14502T ＞ C突变的患者中，仅5例伴有原发位点突变。5.9%(12/204)同时携带两个突变位点，最常见的为m.11778G ＞ A和m.14484T ＞ C原发位点突变合并其他继发位点突变。研究者认为伴随继发位点突变会增加疾病的外显率[14]。另外研究者发现疾病表型与基因型也存在一定相关性，国内外就3个原发突变位点LHON表型进行了分析：m.11778G ＞ A急性起病多，视力受损严重；m.14484T ＞ C与长期预后的最佳视力相关[1,11,15]。目前，基因治疗为LHON患者带来了新的曙光，我国首个眼科基因治疗药物NR082已正式获得国家药品监督管理局批准进行LHON治疗的临床研究[15-17]。

线粒体蛋白组包含约l 500种蛋白质，mtDNA仅编码其中的13种，大部分由nDNA编码，其突变引起的线粒体病占75% ～ 95%[18]。目前已经确定位于核染色体中的30多种基因会影响线粒体功能并导致视神经萎缩[4]。在我们的检测结果中检出17种与视神经萎缩相关的nDNA突变。研究发现DOA主要相关的突变基因为OPA1和OPA3[10]。这两种基因在本研究中的检出率为11.5%(30/260)。而法国的一项研究显示视神经萎缩患者OPA1的突变检出率为30%[8]。两者差异较大的原因可能与种族、地域有关，另外DOA患者发病多见于低龄儿童，此类患者在国内多就诊于儿童专科医院。DOA为常染色体显性遗传，通常父母一方患病，但在本文中具有家族史的患者仅占DOA患者的20.8%，大部分患者为散发病例。这可能由以下因素造成：1)DOA具有不完全外显的特征，父母一方可携带致病基因而无任何临床表现[10]；2)DOA临床表现多样，患者可携带致病基因但因临床症状较轻而未察觉。其他可能与DOA相关的突变基因包括OPA2、OPA4、OPA5、OPA8等[8,10]，但在本研究中并未检测到这些基因。有文献报道，外显子27为基因突变的高发区域[3,8]，而本研究中发现外显子10突变的频率最高。除DOA引起的视神经萎缩外，Wolfram综合征是最常见的与视神经萎缩相关的综合征，WFS1基因突变与Wolfram综合征Ⅰ型、类Wolfram综合征相关，表现为听力障碍伴糖尿病和(或)视神经萎缩；RRM2B基因突变与慢性进行性眼外肌麻痹伴发的视神经萎缩相关[19-20]；Short综合征、视神经萎缩以及Pelger-Huët异常与NBAS突变有关；SLC25A46突变已被确定为常染色体隐性遗传性视神经萎缩的原因[4]。目前对于nDNA突变引起的视神经萎缩尚无有效的治疗方法，及时的诊断以及遗传咨询指导非常有意义。

综上所述，视神经萎缩患者临床表型和突变基因多样，LHON和DOA是导致视神经萎缩的主要类型，临床需重视LHON罕见位点检测，关注除OPA1和OPA3之外的其他nDNA突变及临床表型。疑似诊断为ION的患者应接受全面的神经眼科评估，在排除其他引起视神经萎缩的病因后，必要时可进行遗传分子检测，有助于提高ION的确诊率。