植物-土壤的交互作用：腐殖质的作用

2022-07-05SerenellaNardiAndreaErtaniOrnellaFrancioso侯翠红关红玲

腐植酸 2022年3期

Serenella Nardi，Andrea Ertani，Ornella Francioso 著杨辉侯翠红* 关红玲译

1 帕多瓦大学农学、食品、自然资源、动物与环境学系意大利帕多瓦 35020

2 博洛尼亚大学农业科学系意大利博洛尼亚 40127

3 郑州大学化工学院郑州 450001

腐殖质（HS）包括腐植酸（HA）和黄腐酸（FA），是水体、土壤和大气中有机碳（C）的主要成分，具有很强的抗分解性。HS通常被认为是有机碳中最活泼的部分，因为它们包含许多诸如羧基（-COOH）或酚羟基（-OH）的官能团。在土壤中，这些基团使HS与矿物紧密结合，控制金属的形态和溶解度。有机矿物复合物可防止微生物的攻击，因此HS是稳定的，不易降解，有利于土壤有机碳的循环和固定。

土壤HS在自然和农业生态系统中具有多重生态任务：可以通过螯合矿物质和自身降解提供养分，作为有效有机碳的主要来源构建土壤生物群落。能够决定土壤的健康程度和肥力高低。此外，HS通过诱导植物形态变化、改变微量和大量营养元素的吸收并通过生化途径来影响植物代谢。HS的分子结构及其在植物代谢中的生物活性机制研究取得了重大进展。可溶性HA生物肥料的利用并不是新的研究方向，并且有机农业相对传统农业的扩张有利于促进作物生长的生物刺激剂的市场发展。HA盐等生物刺激素对环境和人类健康有相当大的影响。因此，在不久的将来，HA盐的使用是作物生产的可持续解决方案。本综述不仅讨论了HS对植物生长的影响，同时探讨了HS如何从环境向植物传递信息以提高植物的适应能力。

1 腐殖质的结构

Corrado等详细论述了HS结构的复杂性及其生物活性。因此，本综述只简要概述其主要结果。虽然HS主要的分子结构单元（脂肪链、醌类、酚类和类糖基团）已经被确定，但结构单元的组织形式存在争议。不同的来源环境造成的HS异质性增加了化学成分的可变性。分区模型和聚合物分布模型已被用来表征HS分子结构。然而，相关的实验研究将HS描述为相对小分子的异质超分子混合物，通过相对较小的有机分子之间的非共价相互作用（如π-π、CH-π、范德华力、电荷转移和氢键）或通过具有疏水内部的小胶束结构（避免与邻近的水分子接触）结合在一起。外部亲水结构域由极性基团（如羧酸）组成，而内部疏水结构域由植物大分子组成。由于分子间的相互作用非常弱，当在不同pH值下使用有机酸（一元、二元、三元羧酸）处理时，胶束很容易被分解成不同的较小的聚合物。这些聚合物可能会重新形成胶束，并且胶束化和解聚可能会永续下去。Piccolo发现亲水/疏水比率影响HS在环境中的反应性。

HS的结构主要通过对pH值变化的反应分级成HA和FA进行研究的。在碱性条件下（图1），由于分子内的氢键被完全破坏，HS以分散形式存在。在弱酸性条件下，由于弱的非共价键相互作用（范德华力、π-π、CH-π）被破坏，HS表观分子尺寸显著减小或被分解。在pH〈3时，由于羧酸基团的质子化有利于HS大分子内和分子间氢键的数量增加，HS被破坏（图1）。根分泌弱有机酸释放到土壤溶液中，新的氢键的形成和疏水相互作用的破坏可能有利于HS小聚合物的生物有效性。此外，羧基的性质和分布对确定HS的溶解度和生物反应性尤为重要。

图1 土壤腐殖质在不同pH值水溶液中的表面增强拉曼散射（SERS)光谱Fig.1 Surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectra of soil HS in water solution at different pH values

目前，关于土壤有机质的性质和形成已有不同的理论。Grahams等利用先进的分析技术获得的实验观测结果表明，在土壤中无法检测到“HS”。此外，Lehmann和Kleber提出了土壤连续体模型（SCM），认为“有机物是逐步分解有机化合物的连续体”。在这个框架下，土壤有机质从完整的植物到富含羧酸的有机碳均包含一系列的物质。SCM对有机物的性质给出了完整的解释，正如应用光谱显微技术进行原位表征所示，并未涉及“HS”。基于可观测证据的SCM为模拟土壤碳动力学和土壤管理提供了一种先进的方法。

2 腐殖质结构与生物活性的关系

HS结构与生物活性的关系对了解其在植物中的生物学效应及其利用具有重要意义。首先，HS活性与所产生效应之间的关系是一个复杂的现象。当比较不同来源的HS的生物活性时，期望具有相同的效应和相同的作用机制。然而HS可能通过不同的作用机制产生类似的效应。例如，黑松植物的碳代谢是由富含甲基（-CH3）和羧基（-COOH）的土壤中提取的HS引发的（图2），而来自富含芳香碳和羧基的蚯蚓粪堆肥材料的HS有利于玉米植株侧根的形成。存在研究显示，HS中高水平浓度的羧基抑制了大麦根对硫酸盐的吸收。

图2 高和低分子量腐殖质的1H NMR谱图（4.2～2.0 ppm范围）Fig.2 1H NMR spectra (4.2～2.0 ppm range) of high (HMW) and low (LMW) molecular weight HS

考虑特定官能团对生物活性的影响与不同分子量（MW）组分的关系。Nardi等将HA分成3个组分，降低分子大小以发现其结构与生物活性之间的关系。结果表明，在表观分子大小、分子特征和用量影响下，未分级的HA和3个组分对糖酵解和三羧酸循环（TCA）相关酶的影响大小如下：III〈HA〈II〈I。无论是单独存在还是在未分级的HA中，组分III的最佳效果都可能与灵活的构象有关，这种构象使生物活性HA组分更有效地扩散到玉米细胞中。相反，Canellas等并没有发现HS生物活性与表观分子量分布之间的相关性。Garcıá等描述了HS的结构-性质-功能关系来解释其在植物中的生物活性。分析37个HS组分得出结论：“生物活性的主要差异在于HS结构，其可被理解为超分子结构”。作者还证明了HS的抗逆性和不稳定性是确定植物根构型刺激的重要参数。根的长度和较小的根的形成受脂肪链结构中氧、氮的存在的调节，而较大的根的生长与更复杂的结构有关，如脂肪族和芳香基团。

3 腐殖质在离子吸收中的作用

由于HS复杂性和特征的不完全性，其对根中离子转运的影响不易解释。此外，HS由于土壤来源和提取方法的不同而很难对其进行比较。HS对离子吸收具有选择性作用，其影响程度与HS浓度、植物个体、土壤组成和pH值有关。HS可能对植物的功能有多种影响，其中一些可能直接或间接地导致离子吸收性能的改变。此在转录（6-甲基嘌呤）和翻译（环己酰亚胺）抑制剂的实验中得到了证实。Dell’agnola等证明HS在转录后水平上促进了大麦根中载体蛋白的合成。Nardi等将低分子量腐殖质组分（LMW）应用于玉米幼苗，观察信使RNA数量的变化。研究发现LMW对多肽合成具有转录后效应，从而影响植物整体营养。这一机制与现有研究一致，表明HS（HMW和LMW组分）通过促进硝酸盐载体蛋白的表达和改变一些动力学参数来促进NO3-的吸收。此外，Nardi等研究表明，LMW处理的玉米幼苗也增加了对硝酸盐的吸收，并强烈抑制了玉米微粒体中H+释放和ATP酶。

LMW未通过影响溶质初次运输来促进硝酸盐的吸收，但可能降低了根表面的pH值，从而促进了H+/NO3-的共转运。LMW可与转运蛋白相互作用（精细调控），间接调节NO3-的吸收，在根和培养的胡萝卜细胞中，它可以到达质外体并与质膜相互作用。HS对转运蛋白作用主要来自于HMW和LMW对微粒体部分K+-ATP酶活性的刺激（推测与质膜H+-ATP酶一致）。HA还能促进暴露于钒酸盐的根的质子释放，但这种增加只在培养24 h后才显现。LMW还能加强离体质膜中的H+-ATP酶活性，增加质子梯度并刺激吸收。

Quaggiotti等在LMW处理48 h后的玉米根中发现编码低亲和硝酸盐转运体（ZmNrt1.1）或高亲和硝酸盐转运体（ZmNrt2.1）的基因转录积累没有增加。其他硝酸盐转运体可能参与其中，但HS处理后硝酸盐吸收的增加可能反映了zmNrt2.1转录后/翻译后调控机制和（或）间接吸收调节。此效应可能依赖于H+-ATP酶的作用，产生了跨越质膜的质子梯度，对营养吸收是必不可少的。在这种梯度作用下，植物可能通过次级主动运输获得硝酸盐。此外，LMW处理48 h的玉米幼苗在根中积累了Mha2的转录，表明H+-ATP酶的这种主要的玉米亚型表达是被强烈诱导的。

Agure等证明从风化褐煤中提取的沉积HA增加了根对铁的吸收，并提高了参与铁吸收的基因表达，包括铁（III）螯合还原酶（CsFRO1）、铁（II）-根转运蛋白（CsIRT1）和质膜H+-ATP酶（CsHA2）。Jannin等利用微阵列分析观察到，泥炭HA在油菜根部施用3天后，对地上部720个基因和根部366个基因产生了影响。随着初级硝酸盐（BnNRT1.1，BnNRT2.1）和硫酸盐（BnSultr 1.1，BnSultr 1.2，BnSultr 4.1，BnSultr 4.2）根转运体的表达，根对硝酸盐和硫酸盐的吸收均增加。Mora等在黄瓜中观察到类似的结果，沉积的HA可能是通过提高质膜H+-ATP酶的活性，增加了根对硝酸盐的吸收，从而促进了细胞分裂素从根向地上部的转运。

4 植物-土壤的交互作用

植物存活和作物产量很大程度上依赖于根、微生物活性和土壤组分之间相互作用对不同环境的适应能力。植物-土壤相互作用的研究主要集中于发生在根际的过程。这些过程对于植物吸收养分和抵御病原菌侵袭至关重要。

目前有关根的生物学、生物化学和遗传发育的研究较为充足。相比之下，根际中以根介导的生物过程，如根缘细胞和根分泌物的分泌、碳向根相关共生体的流动、根细胞的死亡和裂解等研究匮乏。

然而，植物的根具有向根际分泌大量化合物的能力：大约5%～21%的光合作用所固定的碳通过根分泌物转移到根。植物根分泌物在不同植物种类之间存在差异，这对微生物和土壤动物组成以及土壤物理、化学和生物地球化学性质有相当大的影响。生长中的植物通过排泄、分泌、脱落和根死亡将有机化合物释放到根际，从而产生与碳循环相关的微生物活性热点，尤其是土壤有机质（SOM）的形成和分解。根分泌物的数量和类型以及土壤的内在特性影响着碳流量的大小和方向。

研究表明，土壤碳矿化是由根分泌物从矿物-有机结合体中释放碳的能力决定的。由于它们限制了微生物和酶的通路，矿物有机结合成为了最重要的碳保护机制。虽然土壤的化学性质（如pH值）对根的生长和矿质养分的有效性非常重要，但矿质养分的吸收取决于根际条件以及根对这些条件的改变程度。根分泌物可通过酸化根、溶解吸附或沉淀阳离子、分泌有机阴离子（螯合剂）等途径直接调动矿质养分，增加养分吸收。

低分子量有机酸在土壤成因和植物生长中发挥着重要作用。它们由土壤生物（少量）、根和发芽的种子（大量）产生和释放。有机阴离子根分泌物在植物-根-微生物相互作用中作为识别信号或植物激素产生的前体引起了人们的广泛关注。Nardi等致力于选择适当的分离和分级HS的方法，并采取适合于识别真正植物反应迹象的程序。用0.1 mol/L KOH提取HS，通过模拟根分泌物的作用进行分级，并通过渗析分离。研究发现，植物根分泌物中存在的简单有机阴离子可能会影响来自土壤HS的物理化学排列。直接起作用的似乎只有与植物吸收相容的LMS。在自然存在的HS物质中，宏观结构上LMS通常与高分子量腐殖质组分（HMS）聚合。

因此，在简单有机酸的作用下，根-土壤界面上发生的LMS-HMS结构的解离可能是HS直接生物作用的先决条件。在实验室过程中，通过有机酸处理将HS提取物分离为明显的低（〈3.5 k）和高（〉3.5 k）分子量组分，分别为LMS和HMS，这2种组分具有不同的类激素活性。为了阐明来自土壤和HS提取物的LMS和HMS诱导释放激素活性的条件，扩大了研究范围。在土壤直接酸化得到的上清液中未检测到类激素活性，而在先前用乙酸或盐酸酸化的HS提取物渗析产生的溶液中检测到类激素活性。0.1 mol/L KOH的提取只能释放类细胞分裂素的活性，而类生长素和类赤霉素的活性仍然与HS提取物结合，分别在pH值为7.5～4.2和4.2～2.5，经乙酸和盐酸酸化后，类生长素和类赤霉素活性几乎完全释放（表1）。

表1 3个玉米品种的干重及其用于土壤提取的根分泌物组成Tab.1 Dry weights of three maize cultivars and the composition of their root exudates used for soil extraction

结果表明，HS类激素活性的释放首先通过反絮凝作用使胶束破裂和HS增溶（pH 11），然后主要通过有机酸处理（pH 2.1）获得解聚。第1个过程（反絮凝）只释放类碱性磷酸酶活性，而第2个过程（解聚）释放吲哚乙酸和类赤霉素活性。另一研究表明，玉米幼苗的分泌物参与了从土壤中提取HS的过程，HS提取的质量和数量取决于植物获取养分的方式，并受到释放有机阴离子的调节。在尺寸排除色谱中，3个玉米品种幼苗根分泌物中的有机阴离子（富马酸盐和琥珀酸盐）将HS从高分子量转移到低分子量（表1和表2）。农业和森林分泌物也用于分离土壤有机组分。与目前使用的碱性溶液相比，根分泌物可能是提取生物活性低分子量（LMW）有机组分更好的介质。

表2 尺寸排除色谱法洗脱腐殖质溶液的特性Tab.2 Characteristics of humic solution eluted by size-exclusion chromatography

Nardi等比较玉米、云杉和樟子松的根分泌物作为提取剂获得的LMW组分与用KOH溶液从农业和森林中提取的HS的生物活性。气相色谱/质谱结果显示，LMW组分相对于HS具有大量的脂肪酸，而傅里叶变换红外光谱则显示了LMW组分与HS具有不同数量的官能团。从类激素活性、硝酸盐吸收和氮代谢等方面评价了樟子松LMW组分与HS的生物活性。来自农业土壤LMW组分提高了硝态氮的吸收、硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，来自森林土壤LMW组分促进了铵态氮的吸收、NR和谷氨酸脱氢酶（GDH）的活性。这些结果表明，LMW组分的化学组成和土壤类型对氮代谢途径有显著影响。因此，LMW组分是根分泌物的重要组成部分，通过提高的大量和微量营养物质的生物有效性来促进生物活性。

Pizzeghello等对59种不同类型的欧洲山毛榉林下的土壤进行了研究，以评估不同植被类型对未溶解和溶解土壤有机质的化学组成和生物活性的影响。采用主成分分析（PCA）方法，分析了各类型间的数据差异。观察到酸性山毛榉林的HS与类生长素活性相关，而中性山毛榉林的HS与类赤霉素活性相关。如先前体外实验所示，土壤pH值和不同的类激素活性之间存在明显的相关性。酸性土壤刺激植物类生长素物质的活性，这些物质在植物根的形成和发育等一系列活动中发挥着重要作用。相反，中性或碱性土壤更有利于类赤霉素活性。

Nardi等在意大利北部2种银杉更新程度不同的森林土壤的溶解有机质（DOM）中发现了植物-土壤交互作用。通过不同浓度的脂肪酸、酚酸和无机营养物质以及类激素活性对DOM进行了表征。结果表明，在银杉种群增长丰富的地方，DOM和HS中都存在脂肪酸、酚酸和类激素活性。相反，在银杉种群增长差的地方，DOM和HS活性分子浓度较低。

Canellas等探索分子质量的动态变化和有机酸存在时HA的生物活性的变化，发现施用HA和柠檬酸的玉米幼苗根面积、主根、根数量、根密度和质膜ATP酶均发生了变化。此外，添加HA的幼苗根分泌图显示草酸的分泌量增加，苹果酸和琥珀酸的分泌量减少。表明了HA与植物之间存在一种交互作用：根中的有机阴离子的分泌受到根发育过程中HA释放的生物活性分子的影响。

综上所述，可以认为，植物通过分泌物能够从土壤中提取对其代谢有积极影响的活性组分和（或）分子。这些组分的作用与HS相同，但它们的化学和生物学特征尚不足以说明它们与碱溶液提取的HS是否相似或不同，或者它们是否代表HS的1个组分。在这种情况下，Lehmann和Kleber提供了关于HS相关概念的非常关键的观点，通过根分泌物证实HS代表土壤有机质。在此观点的基础上，Scaglia等提出，来自植物残体和（或）微生物的分子通过自组装形成具有生物活性的HS。

5 腐殖质生长素效应

HS可诱导生长素的典型生理效应，如前所述，在其结构中可检测到生长素。一些研究者使用了不同的方法来记录HS结构中的吲哚乙酸分子。Pizzeghello等使用免疫分析法从森林土壤、堆肥和蚯蚓粪中的HS中鉴定吲哚乙酸。一系列植物种类的数据表明，生长素的特异性抑制剂（2，3，5-三碘苯甲酸和4-氯苯氧异丁酸）和抗吲哚乙酸抗体可以抑制HS的生物活性。Zandonadi等研究表明，HS对生长素作用的特定分子靶点有诱导作用。HS刺激生长素早期应答基因IAA5和IAA19的表达，并诱导质膜H+-ATP酶的合成、活性和表达。

Ertani等研究了粪肥和矿物施肥对蚯蚓粪便中HS的光谱和生物学特征的长期影响，发现不同施肥措施与从蚯蚓粪中提取的HS的类生长素活性之间存在关系。在高山环境中进行的1项研究发现，雪田鼠的群体引起了有机物转换的剧烈改变，这决定了腐殖化过程的普遍性。这种土壤有机质循环产生的HS具有较高的类生长素活性。

Tahiri等研究了垃圾渗滤液和风化褐煤HS对桤木和桦树根伸长过程中生长素、碳、氮途径及胁迫条件下的生物活性。结果表明，HS及其HA组分通过调节ABCB转运蛋白（ABCB1和ABCB19）转录水平，影响生长素极性运输（PAT）促进根生长。这些数据证实了HS通过促进碳、氮代谢和胁迫反应促进植物生长发育。

Aguirre等研究采用纯化沉积的腐殖质（PSHS），未检测到包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素的植物生长调节剂的可检测浓度，发现PSHS在转录水平和转录后水平影响根和地上部的功能。HS除了通过与吲哚乙酸连接的途径促进根和地上部生长外，还可能存在其他的补充途径或独立于生长素或类生长素结构位点的途径。这些新的互补途径可能与HS促进根对硝酸盐、硫酸盐和铁的吸收密切相关。PSHS可能通过改善根对硝酸盐的吸收和根-地上部间的转运来影响地上部的生长。

Mora等研究得出，PSHS促进了黄瓜地上部生长、根对硝酸盐的吸收以及硝酸盐、细胞分裂素和矿质营养物质的根-地上部间运输。Jannin等利用基于微阵列的油菜籽转录和生理研究证明，HS通过根对硝酸盐吸收和细胞分裂素功能之间的关系影响地上部的发育。施用PSHS可提高根对硝酸盐和硫酸盐的吸收和相应的根转运蛋白的基因表达。PSHS显著地改变了参与调节与矿质营养、激素合成和信号传导（细胞分裂素和赤霉素）、细胞发育和光合作用相关的许多代谢和生理功能的根冠基因的表达。PSHS对根中一氧化氮、吲哚乙酸、乙烯和脱落酸浓度的影响表明，这些植物生长调节剂可能与HS相互作用而改变根的生长和形态。且植物生长调节剂的作用可能因HS刺激形态变化的方式而不同。

研究发现，类激素活性不仅与土壤HS有关，还与堆肥和原料有关。Scaglia等发现猪粪沼液中的DOM具有类生长素活性，这归因于厌氧消化过程中产生的芳香族氨基酸，而未检测到类赤霉素的活性。Scaglia等从原料和相应的蚯蚓粪中提取了类激素活性的物质（通过气相色谱-质谱法鉴定）。羧酸和氨基酸被划分为参与类吲哚乙酸活性的分子。