油田化学表面活性剂生物毒性评价研究＊

2022-07-04贺丽鹏赵桂香耿东士刘卫东田爱民

油气田环境保护 2022年3期

肖啸贺丽鹏赵桂香耿东士刘卫东程芳田爱民

(1.中国石油集团安全环保技术研究院有限公司；2.中国石油天然气股份有限公司勘探开发研究院；3.中国石油天然气股份有限公司油田化学重点实验室；4.中国石油长庆油田分公司西安长庆化工集团有限公司；5.中国石油华北油田分公司质量健康安全环保部)

0 引言

油田化学剂作为贯穿石油生产全过程的重要产品，其应用遍及石油勘探、钻采、集输和储运等工艺过程[1]。随着环境保护法律法规的日益严格及公众环境意识的增强，油田化学剂的生物毒性问题受到了普遍关注和重视[2-4]。在油田化学剂生物毒性测试方法中，最有影响的是美国环保局批准的糠虾生物试验法，但在具体的检测过程中存在试验物种糠虾来源不便、检测准确性不高、重复性差、操作过程复杂耗时等问题[5-6]。我国的油田化学剂生物毒性测试方法的研究起步较晚，目前主要采用的是发光细菌毒性试验法[7-10]。

发光细菌毒性试验法基于发光细菌相对发光强度与化学品浓度相关性，利用灵敏的光电测量系统测定化学品对发光细菌发光强度的影响，根据发光细菌发光强度评价化学品毒性大小的方法[11]。发光细菌是一类非致病的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，最适生存条件为温度20～30℃，pH值6～9，矿化度(NaCl浓度)3%～4%。发光细菌含有荧光素、荧光酶等发光要素，当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其发光要素含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，其发光要素含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低，因而可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，该方法具有检测方法简单、对有毒物质反应灵敏、检测周期短等优点。本文对发光细菌剂生物毒性评价法进行了研究，考察了pH值和矿化度对生物毒性评价结果的影响，并对常用表面活性剂的生物毒性进行评价，同时结合蛋白质含量细菌生物活性法对表面活性剂的生物毒性进行了分析，以期为油田化学表面活性剂生物毒性评价提供可靠的理论基础与依据，同时也为其他油田化学剂的生物毒性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

主要仪器：DXY-3型智能化生物毒性测试仪(中科院南京土壤研究所)；ZHWY-2102C型恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)、LDZM型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、BCM-1000型生物净化工作台(浙江苏净净化设备有限公司)、TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)。

主要试剂：明亮的发光细菌T3小种冻干粉(中科院南京土壤研究所)；革兰氏阴性E.coli菌(中国石油大学(华东)生物中心提供)；牛肉浸膏、胰蛋白胨等生化试剂(国药)；脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、甜菜碱、十二烷基苯磺酸钠(国药)，分析纯；重烷基苯磺酸盐、石油磺酸盐(工业品)。

1.2 实验方法

1.2.1 冻干粉菌剂复苏

按照标准[7]所述方法进行发光菌剂复苏，菌种复苏发光暗室中肉眼应见微光(图1)，生物毒性测试仪检测发光量应在600 mV以上，否则应更换冻干粉。

图1 发光菌活化

1.2.2 不同pH值对发光细菌生物毒性测试的影响

配制不同pH值(pH=2，4，7，10，12)的3%氯化钠溶液，分别取2 mL加入10 μL复苏菌液15 min后测定各组发光强度，每个样品点设置3个平行样。

1.2.3 不同矿化度对发光细菌生物毒性测试的影响

配制不同矿化度氯化钠溶液(0，3%，4%，8%，15%)，分别取2 mL加入10 μL复苏菌液15 min后测定各组发光强度，每个样品点设置3个平行样。

1.2.4 利用发光细菌评价不同表面活性剂的生物毒性实验

按体积比取1份表面活性剂加入9份3%氯化钠溶液，混合后静置60 min后，将此样品液的浓度定为106mg/L，依次稀释成不同浓度样品液(106，105，104，103，102，10，1 mg/L)，未加入表面活性剂的3%氯化钠溶液为空白对照组。分别取不同浓度样品液与对照组液各2 mL加入10 μL复苏菌液15 min后测定各组发光强度，每个样品点设置3个平行样。

1.2.5 利用细菌蛋白质含量变化评价不同表面活性剂的生物毒性实验

取1 mL细菌种子液加入到250 mL无机盐培养基中，向其中加入表面活性剂，配制含不同浓度(0.3，0.6，0.9，1.2 g/L)表面活性剂的溶液。置于37℃恒温振荡器中培养48 h，同时，以未添加表面活性剂、仅有纯种菌的培养基为空白对照组。

1.3 测定方法

1.3.1 发光细菌生物毒性测试

以半最大效应浓度(EC50)确定样品的生物毒性等级[7]。各样品点加入复苏菌液后15 min时的发光强度与对照组发光强度相比，计算得到样品各浓度水平的相对发光度，通过回归方程法求出相对发光度达50%时的样品浓度(即EC50，mg/L)。

T=E样品/Eck×100%

(1)

式中：T为相对发光度，用百分数表示；E样品为样品管的发光量，mV；Eck为对照管的发光量，mV。

1.3.2 细菌生物活性测试

采用考马斯亮蓝法[12]对细胞内蛋白质含量进行测定。取培养48 h后的菌悬液4 mL于离心管中，离心10 min，倒掉上清液，洗涤两次后重悬于4 mL的无菌水中。向洗涤重悬后的菌液中加入0.4 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，将其置于预先准备好的(98±2)℃的水浴锅中，高温煮沸裂解细胞。反应结束后取出冷却至室温，用移液枪吸取1 mL混合液于试管中，向其中加入5 mL考马斯亮蓝溶液，振荡混匀。显色稳定后于595 nm波长处测定其吸光度值，根据标准曲线推算出不同表面活性剂浓度作用下细菌的蛋白质浓度。

蛋白质含量相对值=表面活性剂作用下E.coli菌中蛋白质浓度/空白E.coli菌中蛋白质浓度

2 结果与讨论

2.1 利用发光细菌法评价表面活性剂的生物毒性

2.1.1 发光细菌法评价生物毒性条件优化

测试间隔确定：发光菌被激活之后，其发光强度会随时间的延长而改变，实际分析时必须选择发光变化率较小的时刻测试。从空白样加菌后发光强度随时间的变化情况来看(图2)，发光菌被激活15 min左右，发光强度变化趋与平缓，因此应选15 min为试样加菌到测量发光强度的时间间隔。

图2 发光菌发光强度时间变化曲线

pH值对生物毒性的影响：考察了pH值对生物毒性的影响(表1)，结果表明，强酸性(pH≤4)或强碱性(pH≥10)条件下，在未加油田化学剂的情况下，发光菌的相对发光强度发生大幅度降低，表明强酸性或强碱性对发光菌表现出极大毒性。分析其原因，可能是由于强酸性或强碱性可以抑制细胞活性，细胞发光要素含量下降，进而导致发光细菌发光强度的降低。现有发光细菌法评价油田化学剂生物毒性标准[7]中的pH值范围为6.5～8.5，处于发光菌的最适生存条件pH值范围。

表1 pH值对生物毒性的影响(3%NaCl)

矿化度对生物毒性的影响：进一步考察了矿化度对生物毒性的影响(表2)，结果表明，较高的矿化度(NaCl浓度≥8%)条件下发光菌的相对发光强度降低显著，同样低矿化度(蒸馏水)也可以明显降低发光菌的相对发光强度。分析其原因，可能是由于过高或者过低的矿化度影响细胞生长的渗透压，影响细菌的生长环境，导致细菌发光要素含量下降，进而降低发光细菌发光强度。现有发光细菌法评价油田化学剂生物毒性标准[7]中的矿化度值为3%，符合发光菌的最适生存条件矿化度范围。

表2 矿化度度对生物毒性的影响(pH=7)

2.1.2 发光细菌法评价表面活性剂生物毒性结果与分析

采用发光细菌评价法对油田化学常用表面活性剂生物毒性进行了评价，其中脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚为常用的非离子表面活性剂，甜菜碱为常用的两性离子表面活性剂，十二烷基苯磺酸钠、重烷基苯磺酸盐、石油磺酸盐为常用的阴离子表面活性剂。上述表面活性剂pH值在6.98～8.42，处于发光细菌的最适生存条件范围(pH值6.5～8.5)。从评价结果来看(表3)，脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、甜菜碱、十二烷基苯磺酸钠、重烷基苯磺酸盐体系的EC50值大于20 000 mg/L，属于无毒范围，而石油磺酸盐体系的EC50值介于1 000 mg/L与20 000 mg/L之间，属于微毒范围。进一步分析不同表面活性剂pH值与EC50值之间的关系，总的来看，随着表面活性剂pH值的升高，EC50值有降低趋势。

表3 不同表面活性剂生物毒性评价结果

上述结果表明，发光细菌毒性检测是一种快速、简便、经济的化学品生物毒性评价方法，但在具体的评价中，存在以下几点问题：①发光细菌发光强度不仅与化学品成分及其浓度直接相关，而且受待测体系pH值、矿化度等其他因素的影响，特别是用一些酸性、碱性的化学品直接测量会得出高毒性的结论。当油田化学剂产品体系pH值、矿化度等条件不一致时，不能简单地通过EC50值来比较产品的生物毒性大小。如果按照标准方法[7]将体系pH值调节到中性，虽然可以避免pH值对发光度的影响，但同时也改变了油田化学剂产品的成分性质，不能真实的反映产品的生物毒性水平。②发光菌法得出的无毒结论不能推演到其他高等生物，以烷基酚聚氧乙烯醚为例，发光细菌法评价下表现为无毒，但根据欧盟第2003/53/EC号令，烷基酚聚氧乙烯醚具有急性毒性和对水生物毒性，对鱼类等毒性很大，对眼睛和皮肤具有刺激性，同时表现出明显的致痛性、致畸性和致变异性。因此要结合其他毒性检测方法甄别化学品毒性，将真正具有毒性的化学品排除在使用范围之外。③发光细菌法可以定性的评价化学品毒性，但不能具体反映不同浓度下化学品毒性大小。理论上来讲同一种化学品在不同浓度的毒性作用不同，因此建议对一些表现出微毒或者中毒的的油田化学剂使用浓度进行限制，在没有明显生物毒性的浓度范围内可以正常使用。

2.2 利用细菌蛋白质含量变化评价表面活性剂的生物毒性

蛋白质是细菌细胞内各代谢反应的物质基础，蛋白质含量的高低影响着细菌活性程度，蛋白质的变化可以间接反映生物的生理状态，因此细菌中的蛋白质含量高低可以作为生物毒性评价指标[12-13]。采用与发光细菌同属的革兰氏阴性兼性厌氧细菌E.coli菌，考察不同表面活性剂作用下E.coli菌中蛋白质含量及其变化情况。图3为不同类型表面活性剂对细菌蛋白质含量的影响曲线。在较低浓度条件下(0.3 g/L)，脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、甜菜碱、十二烷基苯磺酸钠、重烷基苯磺酸盐作用下的细菌中蛋白质浓度与空白组细菌中蛋白质浓度没有明显变化，其中脂肪醇聚氧乙烯醚、重烷基苯磺酸盐、十二烷基苯磺酸钠体系在低浓度条件下总蛋白质浓度不但没有降低，反而有上升趋势，体现出一种超补偿机制[14]，该现象与利用发光细菌法检测得到无毒结果吻合。石油磺酸盐采用发光细菌法检测得到微毒结果，但在相同作用浓度条件下(0.3 g/L)，石油磺酸盐作用下的细菌中蛋白质浓度与其他表面活性剂没有明显差别，表明石油磺酸盐本身对细菌没有生物毒性，石油磺酸盐利用发光细菌法评价得到的微毒结果很可能由其较高的pH值导致。

进一步考察了表面活性剂在不同浓度条件下对细菌蛋白质含量的影响，结果见图4。总的来看，不同表面活性剂在不同浓度下对细菌中蛋白质含量的影响趋势相同。随着表面活性剂浓度的升高，蛋白质含量总体呈现降低趋势，表明表面活性剂对细菌生物毒性具有浓度依赖性，低浓度表面活性剂对细菌中蛋白质含量影响不大，高浓度表面活性剂会造成细菌中蛋白质活性或结构损伤，从而干扰细菌的正常生理功能，对细菌生长具有抑制作用。因此简单的将一种表面活性剂评价为有毒或者无毒并不科学，需要结合作用浓度等因素具体考虑。

图4 表面活性剂浓度对细菌中蛋白质含量的影响曲线

通过考察表面活性剂作用下的细菌中蛋白质含量的变化情况来评价表面活性剂生物毒性大小，为表面活性剂毒性效应评价提供了一种新的方法，特别是对一些pH值偏大或者偏小的表面活性剂产品，同时也为其他类型的油田化学剂产品生物毒性评价提供了基础。不同的毒性测试方法都有适用范围，加上油田化学剂成分复杂，使用环境多样，更应根据实际情况选择合适的测试方法[15]。总的来看，不存在对所有油田化学剂都敏感的生物毒性测试，仅利用单一的毒性测试方法无法准确而全面地反映油田化学剂的生态毒性效应，应综合多种评价方法(如鱼类毒性测试、蚤类毒性测试等)对油田化学剂的生物毒性效应进行综合评价，为油田化学剂的绿色可持续方法提供支持[16-17]。