蛋糕中脱氢乙酸提取的正交试验优化及其含量的测定

杨旺火，孙丽香，陈月龙，王秋云，刘财行，陈嘉萍

厦门泓益检测有限公司，肉食品安全生产技术国家重点实验室（厦门 361000）

脱氢乙酸（dehydroacetic acid，DHA），又名脱氢醋酸，是一种新型的人工合成防腐剂，对霉菌和酵母有极强的抑制能力[1-2]。近年来，脱氢乙酸因为其出色的抗菌防腐能力而被广泛地应用在蛋糕等食品中，以延长食品的保质期。脱氢乙酸在人体内的代谢研究尚不完善，但相关研究指出，其在人体内器官和血液中通过与氨基酸作用，从而抑制多种氧化酶[3]，对人体的肾脏、肝脏及中枢神经系统产生影响，并可能引发癌症[4]。为此，美国、日本等国家都制定了严格的限量要求，而在一些欧洲国家甚至明确禁止在食品中使用脱氢乙酸。我国也将其列为SC食品认证相关品类的必检项目，GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定脱氢乙酸在各类食品中的最大使用量限值，其中蛋糕中脱氢乙酸及其钠盐的最大限值为0.5 g/kg[5]。

已报道的食品中脱氢乙酸主要的检测方法有气相色谱法[6-7]、液相色谱法[8-12]、液相色谱-串联质谱法[13]等，而在实际的检测和政府监管工作中主要的检测依据为GB 5009.121—2016《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》。大量的日常检验和企业产品研发检测数据表明，采用GB 5009.121—2016中液相法对蛋糕基质食品中的脱氢乙酸进行测定，其结果与企业实际的添加量存在较大偏差，结果偏低，说明该标准对蛋糕基质的适用性较差。因此，有必要开发一种能够准确测定蛋糕中脱氢乙酸含量的方法，不但能够帮助企业客观地评价产品的安全性能指标，还能够指导企业合理使用添加剂，避免造成不必要的经济损失；另外，一个适用性强、准确度高的检测方法也能为监管部门进行食品安全监管提供有力支持。通过对蛋糕中脱氢乙酸提取条件进行单因素试验，利用正交试验法优化并确定脱氢乙酸测定的最优条件，确立一种能够准确测定蛋糕中脱氢乙酸含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱氢乙酸标准品（纯度99.9%，墨坛质检）；甲醇（色谱纯，德国Meker公司）；乙酸铵（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氢氧化钠、氨水、磷酸、硫酸锌等（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；试验用水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LXJ-IIB离心机（上海安亭科学仪器厂）；Unique-R10超纯水机（锐思捷科学仪器有限公司）；BSA224S-CW分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 脱氢乙酸的提取

蛋糕样品用粉碎机粉碎或不锈钢高速均质器均质后，准确称取2 g样品于50 mL刻度离心管中，加入约10 mL的水，加入不同体积质量浓度120 g/L的硫酸锌沉淀剂，用20 g/L的氢氧化钠溶液或9 mol/L的磷酸溶液，调节至不同的pH后，加水定容至25 mL，充分摇匀，于不同温度下，超声提取不同的时间后，以4 000 r/min离心5 min。取上清液过0.45 μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。

1.3.2 单因素试验

在GB 5009.121—2016《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》第二法的基础上，分别对提取的时间、温度、沉淀剂加入量和提取液pH进行研究，初步确定各因素对脱氢乙酸提取量的影响程度和较佳提取条件。

1.3.2.1 提取时间

分别称取若干份样品各2 g于50 mL刻度离心管中，加入约10 mL水，加入5 mL硫酸锌沉淀剂，用氢氧化钠溶液调节pH至7.5，加水定容至25 mL，充分摇匀，于室温下，分别超声提取5，10，15，20，25和30 min后，以4 000 r/min离心5 min。取上清液过0.45 μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。每个水平进行2次平行试验。

1.3.2.2 提取温度

分别称取若干份样品各2 g于50 mL刻度离心管中，加入约10 mL水，加入5 mL硫酸锌沉淀剂，用氢氧化钠溶液调节至pH 7.5，加水定容至25 mL，充分摇匀，在20，30，40，50，60，70和80 ℃下，超声提取10 min后，以4 000 r/min离心5 min。取上清液过0.455 μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。每个水平进行2次平行试验。

1.3.2.3 沉淀剂加入量

分别称取若干份样品各2 g于50 mL刻度离心管中，加入约10 mL水，分别加入3，4，5，6和7 mL硫酸锌沉淀剂，用氢氧化钠溶液调节至pH 7.5，加水定容至25 mL，充分摇匀，于室温下超声提取10 min后，以4 000 r/min离心5 min。取上清液过0.455 μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。每个水平进行2次平行试验。

1.3.2.4 提取液pH

分别称取若干份样品各2 g于50 mL刻度离心管中，加入约10 mL水，加入5 mL硫酸锌沉淀剂，用氢氧化钠溶液或磷酸溶液调节pH分别为7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5和10.0，加水定容至25 mL，充分摇匀，于室温超声提取10 min后，以4 000 r/min离心5 min。取上清液过0.45 μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。每个水平进行2次平行试验。

1.3.3 正交试验设计

在前期单因素试验的基础上，选取提取时间、沉淀剂加入量、提取液pH和提取温度4个因素的3个较佳水平进行L9(34)正交试验，重复3次，因素水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

1.3.4 脱氢乙酸的HPLC分析

利用高效液相色谱法测定蛋糕中脱氢乙酸含量。精确称取25 mg脱氢乙酸标准品，用20 g/L的氢氧化钠溶解后，用水定容至25 mL，得到质量浓度1.0 mg/mL的脱氢乙酸储备液，用水稀释制得质量浓度1，2，5，10，20和50 μg/mL的标准工作液，与处理后的样液一起进高效液相色谱仪进行分析测试。

液相色谱条件为：色谱柱，月旭XB C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相A 20 mmol/L乙酸铵（每升添加20 μL甲酸），B甲醇（A∶B=90∶10，V/V），等度洗脱；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长293 nm，光谱采集范围190～400 nm；进样量10 μL。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间

如图1所示，在5～15 min的时间段内，随着超声时间的延长，脱氢乙酸提取量的增加幅度较大，从超声5 min的0.173 g/kg增加到15 min的0.258 g/kg，而15 min后则呈现小幅增加，并趋于稳定，这可能是由于在蛋糕基质超声过程中，在前15 min大量游离的脱氢乙酸被水溶液大量提取释放出来，在15 min后由于超声放热，导致蛋糕的基质溶胀，包裹在基质里的少量脱氢乙酸被缓慢释放出来，呈现小幅度增加。因此15 min为脱氢乙酸提取的最佳超声时间。

图1 超声时间对脱氢乙酸提取量的影响

2.1.2 沉淀剂加入量

如图2所示为沉淀剂加入量对脱氢乙酸提取效果的影响。沉淀剂加入量对结果的影响较小，沉淀剂加入量小于6 mL时，脱氢乙酸提取量处于相对稳定的水平，沉淀剂加入量为7 mL时，脱氢乙酸提取量出现略微下降的情况，这可能由于沉淀剂的过量加入，导致基质被沉淀剂覆盖，无法完全提取；沉淀剂加入量为3 mL时，样品在最后过膜时由于蛋白沉淀不彻底，导致阻力较大，容易造成滤膜穿透，样液浑浊，考虑到经济环保的要求，又确保充分沉淀样品中的蛋白，沉淀剂添加量5 mL较为合适。

图2 沉淀剂加入量对脱氢乙酸提取量的影响

2.1.3 提取水浴温度的影响

从图3可以看出，随着超声波温度增加，脱氢乙酸提取量不断增大，温度达到60 ℃后，提取结果趋于稳定，说明随着温度提高，蛋糕基质能更好地溶于提取液，有利于基质中脱氢乙酸的提取，但温度又不宜过高，否则影响试验的可操作性，因此提取温度在50～70 ℃为宜。

图3 水浴温度对脱氢乙酸提取量的影响

2.1.4 提取液pH的影响

从图4中可以看出，随着提取液pH增加，脱氢乙酸提取量不断变大，特别是pH达到8.5时，脱氢乙酸提取值先出现一个跳跃，后趋于稳定，而pH 9.5时出现提取液过膜困难的情况，达到pH 10.0时，沉淀剂硫酸锌与碱发生反应而失效，提取液呈果冻状，无法过膜。脱氢乙酸化合物呈酸性，在碱性环境中呈离子状态，在水中的溶解度增大，更容易被提取出来，随着pH增加，脱氢乙酸的提取量逐渐变大，但pH的增大容易损坏色谱柱，因此较佳的pH范围为8.0～9.0。此外，在碱性的提取环境下，蛋糕基质乳化剂中的油脂可能被皂化水解，减少样品在提取过程中的乳化作用，有利于脱氢乙酸从基质中释放出来，增加提取量。

图4 提取液pH对脱氢乙酸提取量的影响

2.2 正交试验结果

基于单因素试验分析，进行四因素三水平的正交分析试验，试验方案根据表1的因素与水平设计，采用极差分析法对数据进行分析，结果见表2。由表2结果可以看出，各个因素对脱氢乙酸的提取效果影响的主次顺序为C＞D＞B＞A，即提取液pH＞提取温度＞沉淀剂加入量＞提取时间，每个因素中当K值最大为最佳试验组合，即A2B1C2D3，提取时间20 min、沉淀剂加入量4 mL、提取液pH 8.5、提取温度70 ℃时，脱氢乙酸的提取效果最好。

表2 正交试验设计L9(34)提取优化结果

3 实际样品的测定

采用正交试验优化后的最佳组合因素对3家不同生产厂家的3份蛋糕样品中的脱氢乙酸含量进行测定，相同的样品同时按GB 5009.121—2016第二法进行测定，将2种方法测定的结果与厂家的理论添加值进行比较，具体结果见表3。

表3 试验方法、国标方法与理论添加量的比较 单位：g/kg

采用优化后的方法进行测定的脱氢乙酸数值与3家厂商配方的理论添加量较为接近，而国标方法测定的3组数值均只有理论添加量的40%左右，说明国标方法在测定蛋糕中脱氢乙酸含量时结果存在较理论添加值普遍偏低的情况，需进行适当的改进。

4 结论

通过分析提取时间，提取温度、提取液pH和沉淀剂加入量4个因素对蛋糕中脱氢乙酸提取的影响，并通过正交优化试验得到最优组合，结果表明当提取时间20 min、沉淀剂加入量4 mL、提取液pH 8.5、提取温度70 ℃时，脱氢乙酸的提取效果最好。采用最佳的试验条件对不同厂家的蛋糕中脱氢乙酸含量进行测定，结果与理论添加剂值相符，说明该方法准确度高，适用于蛋糕中脱氢乙酸含量的测定。