川青牛胆离体繁殖技术优化研究

胡莹莹 唐 莉 罗 新 刘 帆 黄雪丽* 吴建国 朱福勇

（1雅安三九中药材科技产业化有限公司，四川雅安 625099；2四川农业大学农学院，四川成都 611130）

青牛胆（Tinospora sagittata （Oliv.） Gagnep.）为防己科青牛胆属多年生草质藤本，又称金果榄[1]，含金果榄苷、非洲防己碱、古伦宾等多种有效成分，以干燥块根入药[2-3]，具有治疗咽喉肿痛、泄泻痢疾、抗炎镇痛[4-5]等功效，主产地为四川、湖南和广西等[6]。全球范围内已发现的青牛胆属植物有30多种，我国境内发现的有11种，其中6种具有药用价值[7]。随着医药业的发展，我国对青牛胆的需求迅速增加，导致人们滥采滥挖。20世纪末青牛胆曾一度濒临灭绝[8]。野生青牛胆主要生长在阴暗潮湿处[9]，且雌雄异株，自然环境下雄株数量远大于雌株，自然结实率低，加速了野生资源的减少。人工栽培是缓解青牛胆供需矛盾、拯救青牛胆野生自然资源的有效措施，而种苗则是人工栽培所面临的首要问题，目前对青牛胆的研究主要集中于化学成分、药理以及资源调查等方面，种苗繁育方面鲜有报道。

青牛胆组织培养可实现周年化生产，具有增殖系数较高、占用空间少、管理方便、培养条件可控性强、有效保存优良性状等优点。当前，仅有广西青牛胆的离体快繁技术[10-12]有一定研究，四川青牛胆离体快繁未见报道。本研究利用四川地方优质青牛胆幼嫩枝条为外植体，优化了快速繁殖培养基配方，对青牛胆离体繁殖技术体系进行补充和优化，可为青牛胆人工栽培提供大量优质种苗，以期为实现规模化生产提供技术支撑，为建立优质、高效种苗规范化生产和新品系选育提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

四川雅安三九药业有限公司提供的优质青牛胆幼嫩茎段。

1.2 试验设计

试验采用3因素3水平正交试验设计，A是6-BA（6 苄基腺嘌呤）浓度，设置梯度为 1、2、4 mg/L；B 是NAA（萘乙酸）浓度，设置梯度为 0.1、0.2、0.4 mg/L；C 是 2，4-D（2，4-二氯苯酚）浓度，设置梯度为 0、0.1、0.2 mg/L（表1）。

表1 幼嫩茎段诱导因素水平 单位：（mg·L-1）

1.3 试验方法

1.3.1 试验材料处理。选取新鲜健康的青牛胆幼嫩茎段，剪切为3～4 cm茎段，自来水冲洗30 min，在无菌条件下用75%乙醇浸泡20～30 s，再用0.1%氯化汞处理10 min，无菌水冲洗4次，备用。

1.3.2 启动培养。向MS基础培养基中附加不同浓度配比的植物生长调节剂（表1），附加30 g/L蔗糖和5.5 g/L琼脂。将幼嫩茎段（1.5～2.0 cm）接种至诱导培养基中，每瓶接种6个外植体，每个处理接种5瓶，3次重复。接种后黑暗培养14 d，再移至光照强度2 000 lx、光照时数 12 h/d、温度（23±2）℃条件下进行培养。40 d后记录不同培养基配方下幼嫩茎段诱导率及不定芽生长情况，并筛选出最佳幼嫩茎段诱导培养基。

1.3.3 增殖培养。将启动培养基中诱导出的不定芽剪切成1～2 cm茎段，转接至表2增殖培养基中，在培养基中附加30 g/L蔗糖和5.5 g/L琼脂，每瓶6个外植体，每个处理接种5瓶，3次重复。在光照强度2 000 lx、光照时数 12 h/d、温度（23±2）℃条件下培养，40 d后统计增殖系数及其长势。

表2 增殖培养植物生长调节剂配比单位：（mg·L-1）

1.3.4 生根培养。采用单因素设计，在MS基础培养基中，添加不同浓度的NAA和IBA（表3）。将组培苗剪切至1～2 cm，转入生根培养基，每瓶接6株，每个处理5瓶，3次重复。接种后在光照强度2000lx、光照时数 12 h/d、温度（23±2）℃条件下培养。 40 d后记录生根率和新生根生长情况，筛选出最佳生根培养基。

1.3.5 炼苗移栽。生根苗炼苗后移栽，移栽15 d后统计成活率。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂配比对不定芽诱导的影响

由表4可知，除9号处理外，其他8个处理均可成功诱导出不定芽。从诱导率看，1号处理腋不定芽诱导率最高，达90.0%；其次为4号、2号和3号培养基，诱导率分别为86.7%、83.3%和80.0%。从分株数量分析，1号处理和4号处理分株数量最高，分别为4.1株和3.6株，远高于其他处理组合。从不定芽生长状况分析，1号、2号、3号、4号处理，经过15 d培养，基部叶子变黄，基部膨胀变大，随着培养时间的延长，诱导不定芽的叶色绿，芽健壮，顶端有绿色叶子萌动迹象。但是，生长速率有所差异，其中，1号和4号处理生长速率均较快，芽的长度最长。5号和6号培养基诱导率分别为76.7%和43.3%，诱导芽较纤细，叶片均未舒展。7号、8号、9号培养基诱导效果最差，诱导愈伤组织，且愈伤组织疏松，呈浅黄色，仅有少量的芽点，随着培养时间的延长，基部变黑变大，基部附近培养基出现褐化现象，原有的顶芽黄化，茎部萎缩，生长迹象逐渐消失，逐渐褐变死亡。综上所述，最佳不定芽诱导培养基为1号培养基，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表4 不同植物生长调节剂配比对茎段的诱导情况

2.2 不同植物生长调节剂配比对不定芽增殖的影响

将启动培养获得的健康幼苗转接至表2培养基中，结果表明，1号增殖培养基的幼苗长势缓慢，未形成丛生芽，2号、3号、4号增殖培养基均可产生丛生芽，分别为4.5、4.2、4.8株，但从丛生芽生长状态来看，2号增殖培养基培养丛生芽茎部相对较粗，植株长势良好，生命力旺盛，叶色浓绿，且生长较快，13 d左右即可长出新芽。4号增殖培养基诱导丛生芽较纤细，培养后期逐渐变黄，不利于后期生根。由此可见，在本试验范围内，0.5 mg/L 6-BA与0.05 mg/L NAA的组合对青牛胆丛生芽生长、增殖效果最佳，诱导出的丛生芽生长最快。因此，最佳增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。

2.3 不同植物生长调节剂配比对青牛胆生根的影响

由表5可知，5种培养基均成功诱导出不定根，其中3号、4号、5号培养基生根诱导率相当，均在95%以上，以5号培养基生根率最高，达97.5%，且根系萌动时间最早，第5天开始露白，植株叶色浓绿，健壮。2号培养基根系12 d后开始萌动，根系生长缓慢。1号空白培养基诱导率最低，仅为49.5%，且根系萌动时间最长，培养15 d后根系开始有萌动迹象。由此表明，NAA和IBA不同配比均能诱导根的生长，最佳生根培养基为MS+0.5 mg/L IBA。

表5 不同浓度生根剂对不定根诱导情况的影响

2.4 炼苗移栽情况

生根培养30 d后，当80%组培苗根长至7～8 cm时，拧松瓶盖，2 d后将瓶盖全部打开，3 d后放置于全天自然光照、温度25℃的通风条件下炼苗。7 d后将苗取出，洗净附着在根上的培养基，并移栽到营养土∶珍珠岩=3∶1（体积比）的苗床上。移栽后的前5 d用透明塑料棚保温保湿，保持空气湿度在85%以上，每天喷灌1次，5 d后慢慢通风，接受自然光照，移栽15 d后成活率高达100%。

3 结论与讨论

植物细胞在理论上都存在全能性，任何植物的器官或组织都能作为组织培养的外植体[13]。本试验采用青牛胆幼嫩茎节诱导繁殖，能快速繁殖并获得大量植株，是一种非常有效的繁殖途径。本试验在潘丽梅等[10]的基础上降低了2，4-D浓度，并将KT换成NAA，诱导得到的不定芽并无玻璃化问题，且长势好，速度快。茎段可以为再生苗提供营养，促进壮苗，每丛不定芽能够再分化出丛生苗，大大降低了青牛胆育苗成本，更符合离体微繁的目的。在生根培养时，IBA和NAA可诱导生根，相对而言，IBA诱导效果优于NAA，这一结论与李小泉等[12]的研究结果相似。综上，本试验青牛胆最佳启动诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，最佳增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，最佳生根培养基为MS+0.5 mg/L IBA，炼苗移栽后成活率高达100%，该试验体系为青牛胆规模化生产实践提供了一定的技术参考。