单细胞测序技术在食管癌研究中应用的进展

张丽亚综述；张成娟审阅[郑州大学附属肿瘤医院（河南省肿瘤医院）生物样本中心，河南 郑州 450008]

食管癌是恶性程度较高的消化道肿瘤之一，分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinomas，ESCC）与食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）两种病理类型。2020 年全球癌症数据统计结果显示，全球食管癌发病例数在36种癌症中占3.1%，排第7位；死亡例数占5.5%，排第6位[1]。中国是食管癌高发国家，每年新发患者和病死患者数均居世界第一，5 年生存率较低[2]。随着分子生物学技术革新和生物信息学蓬勃发展，相关研究给食管癌患者带来了福音，病死率有所下降，但目前对于食管癌发生发展的分子机制了解有限，仍缺乏有效地用于筛查、监测治疗和预防侵袭转移的分子靶点。

传统测序采用的是多细胞混合样品，得到的序列信息是一群细胞遗传信息的平均值，或者是其中占优势细胞的遗传信息，而忽略了细胞之间的异质性。单细胞测序（single cell sequencing，sc-Seq）是在单个细胞水平上对其携带的遗传信息进行测序，揭示单个细胞之间的差异，为肿瘤分子分型和精准治疗提供精细化指导，有助于研究肿瘤异质性及其发生发展机制。为更精准地从分子层面阐述食管癌的发生、发展和转移的机制，提高食管癌诊断及个体化治疗的水平，sc-Seq技术越来越多地应用于食管癌的研究中，本文就sc-Seq技术及其在食管癌研究中的应用进展作一综述。

1 sc-Seq技术简介

2009年，TANG等[3]实现了首次单细胞RNA高通量测序，sc-Seq 技术被《自然方法》评选为2013 年度的创新技术。近年来，sc-Seq 技术不断发展进步，已在基因、转录、蛋白质和表观遗传等多个组学水平完成测序，可以在单细胞水平上检测单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）[4]、拷贝数变异（copy number variation，CNV）[5]、基因表达改变等。

sc-Seq 的主要流程包括单细胞样本准备、单细胞分离和提取、核酸扩增、文库构建、测序及数据分析等步骤（图1）。

图1 sc-Seq流程示意图

1.1 单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing，scRNA-Seq）

scRNA-Seq需先将mRNA逆转录成cDNA，再进行扩增产生高通量测序文库。scRNA-Seq的灵敏度、精确度和分析细胞数量的组合决定了检测表达水平的相对差异。表1 总结了当前主要的scRNA-Seq 技术方法的优缺点。

表1 常用的各种scRNA-Seq方法

1.2 单细胞基因组测序（single cell DNA sequencing，scDNA-Seq）

单个二倍体细胞仅含6 pg DNA，为获取足够多的DNA 进行测序，需要在测序前对DNA 进行扩增，主要技术为全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）。目前，WGA 可细分为连接锚定PCR（ligation anchorage PCR，LA-PCR）、简并寡核苷酸引物聚合酶链反应（degenerate oligonucleotideprimed polymerase chain reaction，DOP-PCR）、多重置换扩增法（multiple displacement amplification，MDA）、多重退火环状循环扩增法（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC），以及转座子插入的线性扩增（linear amplificationviatransposon insertion，LIANTI）等。表2总结了当前主要的单细胞基因组测序技术方法。

表2 常用的scDNA-Seq方法

1.3 单细胞表观遗传组测序（single cell epigenome sequencing，sce-Seq）

表观遗传状态也影响着细胞的功能，包括DNA甲基化、羟甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调节、染色质构型及结合在染色质上的结构和调节蛋白等。单细胞亚硫酸氢盐测序（single-cell bisulfite sequencing，scBS-Seq）[17]允许定量测量整个小鼠基因组中多达50%的CpG 双核苷酸的DNA 甲基化。亚硫酸氢盐转换的随机整合片段测序（bisulfiteconverted randomly integrated fragments sequencing，BRIF-Seq）是一种具有高读取率和基因组覆盖率的方法，可用于具有不同遗传背景的任何物种的单细胞甲基化组分析[18]。转座酶可及染色质测序的单细胞分析（single-cell assay for transposase-accessible chromatin sequencing，scATAC-Seq）是通过分析Tn5转座酶来定义和量化染色质的可及性，检测染色质开放程度的技术，可用于表观遗传学研究，而且所需细胞量少、操作时间短[19]。

表3 常用的scCOOL-Seq方法

1.4 单细胞多组学测序（single-cell multi-omics sequencing，scCOOL-Seq）

单细胞多组学联合分析，可从同一个细胞中获取基因组、表观组、转录组和蛋白组学的信息，整合多组学信息对单个细胞进行综合理解[20]。表4 总结了当前主要的scCOOL-Seq技术方法。

表4 sc-Seq技术在食管癌临床前研究中的成果

随着sc-Seq技术不断成熟，更多的研究者将其应用于肿瘤研究中，揭示肿瘤内细胞的异质性及描绘肿瘤微环境（TME）、分析肿瘤发生发展和转移机制、筛选分子标志物，及其指导治疗、评估预后及监测复发等。现在，sc-Seq 技术已广泛用于多种恶性肿瘤，如血液病[25]、乳腺癌[26]、肺癌[27]、肝癌[28]、结直肠癌[29]、黑色素瘤[30]、膀胱癌[31]和卵巢癌[32]等的研究。

2 sc-Seq技术应用于食管癌发生发展机制的研究

sc-Seq 技术的广泛应用预示着探索肿瘤异质性和肿瘤进展过程中亚克隆结构动力学新时代的到来。scRNA-Seq 是一种可用于分析细胞组成和阐明组织中细胞状态转变的新技术[33]。其改变了人们对肿瘤细胞组成的理解，使之能够识别新的细胞亚型。此外，可以更清楚地了解肿瘤发生的分子机制，并揭示整个肿瘤发展过程中的体细胞突变[34]。

YAO等[35]建立模拟人类ESCC发育的小鼠模型，通过高通量scRNA-Seq，阐明了ESCC发展过程中每个不同病理阶段鳞状上皮细胞和TME细胞的过渡状态和转录组学特征，有助于更好地了解ESCC的发生和发展，为开发ESCC早期诊断和精准治疗策略的分子标志物奠定了基础。ZHANG等[36]基于scRNA-Seq分析发现ESCC 肿瘤中的上皮细胞有8 种基因表达模式，并且每种基因表达的高低在肿瘤之间具有高度异质性，而且发现与Ⅰ期ESCC肿瘤相比，Ⅱ/Ⅲ期肿瘤的T 细胞衰竭和Treg 细胞评分显著升高，表明ESCC 肿瘤微环境中的免疫抑制状态随肿瘤进展而恶化，该研究通过sc-Seq发现了ESCC肿瘤中B细胞激活、增殖和分化的关键机制。CHEN 等[37]对5 份ESCC 样本和相应的非恶性样本进行scRNA-Seq 分析并检索公共数据库中的RNA 测序数据，发现肿瘤细胞的基因表达和CNV 状态表现出高度的异质性，并构建揭示ESCC恶性细胞异质性的转录图谱，该研究将有助于理解ESCC 患者的肿瘤微环境和细胞异质性，为未来深入探讨ESCC的发病机制和识别潜在的治疗靶点提供有价值的资料。

Barrett食管（Barrett's esophagus，BE）是一种常见的化生疾病，根据形态学特征分为不同阶段，这些阶段与发展为EAC 的风险相关。BE 的细胞来源仍是未知的。单细胞转录组学分析、甲基化细胞系追踪、开放染色质和体细胞突变分析以及类器官模型中的功能研究等组合分析表明，BE 细胞通过c-MYC 和HNF4A 驱动的转录程序起源于贲门[38]。此外，EAC可能起源于未分化的BE细胞类型，即使在没有可识别的化生病理形态的情况下也如此，这就是早期检测策略。BUSSLINGER 等[39]用新鲜的BE 活检组织进行了scDNA-Seq 和scRNA-Seq 分析，可以深入了解BE 不同阶段的突变情况和基因表达模式。OWEN 等[40]对6 例BE 患者的活检组织进行scRNASeq 发现，以LEFTY1 和OLFM4 为标志的BE 中的细胞群与食管黏膜下腺细胞存在显著的转录重叠，但与胃或十二指肠细胞无关。

这些研究证明了临床样本单细胞分析的优势，它可用以揭示食管癌组织中细胞类型和细胞异质性之间的生物学关系，为研究食管癌发生发展机制提供有力工具。

3 sc-Seq技术应用于诊疗和预后相关标志物的研究

各种肿瘤相关的大部分基因已经查明，并可作为特定类型肿瘤相关的生物标志物，sc-Seq技术可以识别食管癌诊断和预后相关的标志物。DINH等[41]通过分析食管癌包含成纤维细胞的scRNA-Seq 数据，确定了具有预后价值和潜在生物学意义的CST1+肌成纤维细胞的肿瘤特异性亚群。ZHENG 等[42]利用GEO 微阵列数据集和癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据集，筛选与ESCC 诊断和预后相关的可能的生物标志物，并通过UALCAN 数据库、scRNA-Seq 和qPCR 验证所鉴定基因的表达水平，查明PBK、KIF2C、NUF2、KIF20A、RAD51AP1 和DEPDC1 都是ESCC 诊断的潜在生物标志物和治疗靶 点。ZHANG 等[36]发 现，表 达AGR2/CXCL17/MUC20的上皮细胞比例与scRNA-Seq数据中的黏膜基因表达模式的评分相关，表明这三个基因可以共同用于预测黏膜基因表达模式的激活，而高黏膜基因表达模式的ESCC 其恶性程度相对较低，因此AGR2/CXCL17/MUC20 高表达模式与ESCC 较长存活时间相关，可以作为预后相关标志物。

4 sc-Seq技术应用于食管癌治疗的研究

食管癌的治疗方式主要包括手术、术前新辅助放化疗、围手术期化疗、术后化疗、靶向治疗及免疫治疗，手术是食管癌治疗的主要手段。近年来，分期方法、患者选择、术后护理和手术经验的改进使患者术后复发率和死亡率都有所降低[43]。但由于组织学、分子生物学和病因学的异质性，食管癌患者通常预后不良，5年生存率仍然很低，因此，利用新技术探寻新的治疗和预防侵袭转移的靶点及分子机制对食管癌的有效控制至关重要。sc-Seq技术的应运而生，为了解单个细胞群之间的相互作用和功能障碍，从而为开发新的食管癌干预措施提供了机会。

4.1 sc-Seq技术在食管癌化疗中的应用

新辅助和围手术期化疗或放联合化疗的目的是减小原发肿瘤体积、增加根治性切除的可能性、治疗微转移性疾病和降低未来全身复发的风险，最终将显著提高晚期食管癌患者的生存率[44]。耐药性是癌症治疗中的一个主要难题，尤其是对化疗药物的耐药性。在整个细胞分化过程中经过各种分裂和增殖后，肿瘤细胞内部的众多生物学或遗传差异导致形成复杂的肿瘤异质性，肿瘤细胞内基因表达的异质性可能是导致耐药的主要因素之一[45]。

紫杉醇广泛用于包括ESCC 在内的多种癌症的联合化疗中，然而，紫杉醇耐药经常发生，其机制尚不完全清楚。WU 等[46]对来自KYSE-30 细胞和具有紫杉醇抗性的KYSE-30 细胞进行scRNA-Seq，揭示了参与ESCC 对紫杉醇耐药的内在和获得性信号通路。发现蛋白酶体的高表达和HIF-1 基因的低表达参与ESCC获得性紫杉醇耐药，并提出蛋白酶体抑制剂（carfilzomib，CFZ）可以通过抑制蛋白酶体和激活HIF-1 基因可逆转紫杉醇耐药。尽管还需要进一步的验证，但是该团队研究结果为解决ESCC对紫杉醇耐药提供了新思路。

WU 等[47]应用sc-Seq 发现了与ESCC 和EAC 相关的基因特征和关键的肿瘤相关信号通路，揭示了由于ESCC 和EAC 在转录组学方面的不同，导致这两种肿瘤间广泛的细胞异质性。这一发现表明，需要针对两种类型食管癌之间的差异采取不同的治疗策略，以指导未来药物开发和临床应用。该团队[48]还利用scRNA-Seq 描述了EAC 和ESCC 中肿瘤干细胞的详细表达谱，结果表明EAC 中细胞周期相关基因的过表达与干细胞特性高度相关，而参与DNA 复制和DNA损伤修复信号通路的基因过表达与ESCC干细胞特性显著相关。这些发现对EAC患者中使用细胞周期抑制剂和在ESCC患者中使用PARP抑制剂具有理论指导意义。

肿瘤药敏试验为癌症患者选择最佳化疗方案方面起着关键作用。以往高通量药物筛选方法没有考虑到肿瘤细胞的异质性，因此对个别癌症患者治疗反应的预测能力有限。单细胞药敏试验（single cancer cell drug sensitivity testing，SCC-DST）是最近发展起来的一种用于评估单细胞对不同抗肿瘤药物的不同敏感性的方法。YANG 等[49]讨论了将SCCDST 与scRNA-Seq 相结合以揭示耐药机制的可行性，并利用人工智能来促进各种组学数据在药物敏感性评估中的分析，在精准医学时代，SCC-DST正在为癌症患者更好地选择药物奠定基础。

KRÄMER等[50]开发了一种通过荧光激活细胞分类和随后的RNA 测序从EAC 活检中分离出白细胞（CD45+）、上皮细胞（EpCAM+）和成纤维细胞（PDGFRα 和CD90）。与scRNA-Seq 相比，这种方案可以作为一种补充，用以研究EAC 中特定细胞群的临床参数和转录组改变之间的关系，并有可能在大量EAC患者中获得与治疗相关的资料。

4.2 sc-Seq技术在食管癌放疗中的应用

YANG 等[51]对放疗前后肿瘤组织进行单细胞全外显子组测序（single-cell whole-exome sequencing，scWES），发现了42个放射反应基因，包括NOTCH1、MAML3、CDKN2A、NFE2L2、GAS2L2、OBSCN 和TP53。scWES数据可以发现ESCC相关的突变，以及肿瘤内和肿瘤间的细胞异质性，该团队对ESCC放射抗性遗传基础的这些新见解，为食管癌提供了新的治疗靶点。该团队[52]对分次照射（fractionated irradiation，FIR）的ESCC 的KYSE180 细胞进行了scRNA-Seq，发现单个ESCC 细胞暴露于FIR 的差异基因表达模式，并发现了与辐射抗性发展相关的基因和信号转导途径。WU 等[53]利用scRNA-Seq 揭示了受辐射的ESCC细胞的异质性，以及在肿瘤放疗时ESCC抗辐射细胞亚群的增加。总体而言，这些结果具有潜在的临床意义，因为他们确定了许多与放射抗性相关的信号分子，提供了开发ESCC的新放疗方案的机会。

4.3 sc-Seq技术在食管癌免疫治疗中的应用

值得注意的是，相同分期的食管癌患者临床预后不同，不能仅用分子异质性来解释，还应该关注TME[54]。TME由肿瘤细胞、浸润性免疫细胞、间质细胞和其他细胞类型以及决定疾病进展和治疗反应的非细胞组织成分组成[55]。免疫疗法改变了癌症治疗的模式，免疫检查点抑制剂如PD-1 或PD-L1 抗体已被批准用于许多类型的癌症治疗。sc-Seq 技术为在高度复杂的TME中全面研究这些细胞提供了一条途径，让人们更全面地了解其在肿瘤发生发展中的作用，探索肿瘤相关免疫细胞中较为关键的基因和表面标记，发现免疫治疗的新目标。

T 细胞耗竭是指慢性感染和癌症患者由于长期暴露于持续性抗原和炎症，T 细胞逐渐失去效应功能。CHEN 等[56]通过分析T 细胞的scRNA-Seq 数据，确定了ESCC 的TIL 的特征，发 现SPRY1（sprouty RTK signaling antagonist 1）在CD8+T细胞中高表达，并可抑制TCR信号通路和细胞因子的产生。研究还强调了FGF2作为SPRY1表达的重要调节因子，参与了CD8+T细胞功能紊乱状态的建立，提示抑制FGF2在ESCC中具有重要临床价值。ZHENG等[57]结合高通量scRNA-Seq 和T 细胞受体测序（T cell receptor sequencing，TCR-Seq），展示了ESCC 中固有和获得性免疫细胞图谱，全面揭示了TIL 的动态变化，从多个方面阐述了ESCC的免疫抑制状态，这些都是开发ESCC和其他癌症免疫治疗的潜在新靶点。

5 结语

sc-Seq 技术逐渐成熟，推动肿瘤研究进展，但是该技术仍存在一定缺陷，如耗时长、对样本质量要求高、花费大、可能存在误差等，有极大的改进空间，这些缺点会随着技术的完善被逐步解决。目前有学者[58]通过结合单细胞和空间转录组学来绘制不同骨髓生态位的分子、细胞和空间组成，提供了一个系统解析整个器官复杂组织的技术。空间转录组学可逐渐揭示细胞的时空异质性，sc-Seq与空间转录组技术联合起来可以更深入地研究食管癌。

目前，很多单细胞研究的样本量较小，这可能导致结果具有一定的局限性，并不代表所有的食管癌患者，但在探索食管癌发生发展的机制、解决患者耐药和放射抵抗问题，以及食管癌精准医疗发展等方面提供了新视角，为食管癌预防和治疗研究带来了新技术。同时，一些研究结果也引出了更多值得关注和探索的问题，例如鉴定出的不同细胞亚群在食管癌中怎样发挥作用、在疾病不同阶段或不同位置有哪些变化等。未来应继续将sc-Seq 与传统的研究方法结合，扩大样本量，在已有理论基础上更加深入细致地研究肿瘤起源、发生发展、耐药等相关问题，将研究结果向临床转化，开发出有效的预防、诊断和治疗的方法。