克服免疫屏障的黏膜疫苗递送技术研究进展

张远冬，孙逊

（四川大学华西药学院，四川 成都100046）

19至21世纪，科学家研制出了对抗伤寒、流感、人类乳头瘤病毒等多种感染性疾病的疫苗，每年拯救数百万人的生命，为人类社会带来重大利益。尽管疫苗科学在过去近200年取得了长足发展，但疫苗仍未能控制和消除部分严重的感染性疾病，如严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）、艾滋病、结核病等。其中一项原因是大多数病原微生物（约90%）均通过人体呼吸道、消化道、阴道等黏膜表面感染机体。最有效的疫苗应同时引发系统性免疫应答和黏膜免疫应答，在病原体的入侵部位构筑第一防线，阻断其感染[1]。然而，目前临床使用疫苗多采用肌肉、皮下注射。这种传统免疫方式能够诱导系统性免疫应答，但无法激活足够的黏膜免疫应答，因而不具有黏膜防御能力[2]。相较而言，经黏膜（鼻内、口服、阴道等）接种的疫苗能够很好地激发黏膜组织驻留T细胞应答，并促进黏膜分泌免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）抗体，在建立黏膜免疫记忆和效应方面比注射疫苗更有效，因而能够有效预防黏膜病原体的感染[2]。

在感染性疾病全球爆发期间，采用非侵入性的黏膜接种方式更为有利。黏膜接种易于实施，无需专业卫生人员注射，同时生产和储存成本较注射疫苗更低，这意味着经黏膜途径免疫具有更好的依从性和适用性，能够更迅速地在全球推广和应用。然而遗憾的是，黏膜递送过程需要克服复杂的生理屏障，如黏膜表面存在黏液、降解酶或具有紧密连接的上皮细胞层等。目前，虽已有经口服和鼻腔免疫的疫苗上市，但其数量屈指可数（见图1），且多为减毒或灭活疫苗。这类疫苗存在灭活不彻底、毒力恢复等隐患。近些年发展起来的重组蛋白疫苗、核酸疫苗等新型疫苗比减毒或灭活疫苗具有更明确的成分、高度特异的免疫原性和更高的安全性。但是这些新型疫苗免疫原性弱，易被降解，不适用于直接黏膜给药。

图1 已上市的黏膜疫苗Figure 1 Licensed mucosal vaccines

近年来，创新的纳米递送技术为提高黏膜疫苗的有效性和适用性带来了机遇。纳米递送系统以明确的成分、稳定的结构和特殊的理化性质，极大促进了黏膜部位对抗原的摄取，并将疫苗成分运送到关键免疫细胞或淋巴组织，刺激免疫细胞成熟，最终实现高效的免疫保护。本文总结了近年来黏膜免疫系统（mucosal immune system，MIS）的研究进展，以及先进的递送技术在黏膜疫苗开发中的应用；同时，讨论了递送载体与黏膜屏障相互作用的机制，从而更好地理解黏膜免疫策略，以期为开发新一代黏膜疫苗提供参考。

1 黏膜免疫系统

MIS主要由沿呼吸道、消化道、泌尿生殖道黏膜上皮分布的淋巴细胞、淋巴组织和某些外分泌腺体（唾液腺、乳腺和胰腺等）构成。黏膜表面总面积超过400 m2，构成了人体最大的器官之一[3]。由于黏膜表面持续暴露于外界环境中，不断与微生物接触，故MIS必须训练出精准的策略以防御有害病原体，并演化出复杂的反应机制，通过诱导免疫反应来保护机体或通过诱导免疫耐受来维持黏膜部位的生态平衡。不同部位的MIS在组成和解剖组织学上存在差异。呼吸道MIS由鼻相关淋巴组织（nasal associated lymphoid tissue，NALT）、 支气管相关淋巴组织（bronchus associated lymphoid tissue，BALT）、腺样体等组成[4-5]。肠MIS主要包括肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue，GALT）和肠系膜淋巴结（mesenteric lymph node，MLN）[6]。GALT主要有派氏结（Peyer's patche，PP）和孤立淋巴滤泡（isolated lymphoid follicle，ILF）[6]。PP是肠道免疫系统的主要淋巴结构，其被卵泡相关上皮（follicle-associated epithelium，FAE）覆盖而与肠腔分离。FAE的特征是存在微褶细胞（M细胞）。PP还包括一个口袋状区域，称为“生发中心”，其中含有以B细胞为中心而外周环绕T细胞群的滤泡和淋巴管[6]。ILF的外观和成分与微型PP相似，并广泛分布于肠道黏膜[6]。生殖道黏膜缺乏典型的淋巴组织。但有研究发现子宫黏膜的固有层（lamina propria，LP）中存在中心富含B细胞，外周有大量CD4+和CD8+T细胞环绕的淋巴滤泡；同时在阴道上皮内分布大量的树突状细胞（dendritic cell，DC）、CD86阳性巨噬细胞、内源性抗菌物质等共同组成了阴道免疫防御系统。

由于解剖组织学和功能上的差异，MIS一般分为免疫诱导部位和免疫效应部位。NALT，BALT，PP，MLN，ILF共同作为黏膜免疫应答的起始诱导位点，免疫效应部位主要包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜部位的固有层组织。抗原在诱导部位被提呈和处理，并提呈给幼稚T和B细胞，最终引起T和B细胞效应性免疫反应和记忆性免疫反应。这些效应性和记忆性T和B细胞均能够通过特定的组织归巢受体到达效应部位发挥免疫保护作用，或可以进入淋巴-血液循环发挥系统免疫作用。趋化细胞受体（chemoattractant cell receptor，CCR）被认为是淋巴细胞黏膜归巢的重要受体。如CCR9和整合素α4β7被认为是肠道黏膜淋巴细胞归巢的主要受体。CCR9特异性配体CCL25就表达于小肠上皮细胞[7-8]。研究发现，系统激活的CXCR3+CD8+T细胞在趋化因子CXCL9和CXCL10作用下可以被大量招募到阴道黏膜部位[9]。黏膜免疫一般能够同时在疫苗接种位点和其附近的黏膜组织发挥免疫效应。如强效的口服疫苗能够在肠道和生殖道同时引起免疫反应；鼻腔疫苗不仅能够在肺部和上呼吸道引起免疫保护，同时也可以在远端黏膜，如消化道和生殖道黏膜产生免疫应答，但通常鼻腔疫苗激活的肠道免疫效果较差。

2 黏膜部位抗原呈递和诱导免疫应答的机制

黏膜免疫首先是黏膜诱导部位抗原被摄取，进一步被加工和处理成抗原肽；而T和B细胞可以通过其自身受体特异性识别抗原肽。接着，T和B细胞被激活并增殖分化形成免疫效应细胞。免疫效应细胞通过淋巴管道和血管运输到机体其他免疫器官，或归巢到黏膜效应部位。在效应部位，免疫效应细胞和效应分子共同发挥作用，最终完成免疫应答。黏膜免疫最关键在于抗原必须被诱导部位抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）摄取，并转运到淋巴细胞。APC是介导免疫反应的基础，黏膜诱导部位的抗原呈递涉及一系列APC的通力协作，包括M细胞、DC、巨噬细胞和上皮细胞等（见图2）。

图2 黏膜部位抗原摄取和免疫应答机制Figure 2 Mucosal antigen sampling and the response mechanism of mucosal immune system

M细胞被认为是黏膜免疫的门户，是一种特殊类型的肠上皮细胞。其来源于核因子-κβ（nuclear factor κβ，NF-κβ）配体激活剂RANKL诱导上皮干细胞分化而成[10]。M细胞表面缺乏微绒毛和正常的黏液层，基底面内陷形成了能包含APC的“口袋”；同时，M细胞具有较高的内吞活性，且胞内溶酶体较少，抗原不易被降解。这些独特的结构和性质使腔道内的抗原极易被M细胞摄取，并高效转运给“口袋”内APC[11]。一直以来，在众多的黏膜免疫策略中，靶向M细胞的疫苗递送技术始终处于主导地位。胃肠道中，M细胞主要分布于PP或ILF表面的FAE中，少数分布于小肠绒毛上皮。鼻腔中M细胞主要存在于NALT表面的FAE细胞间。最新的研究发现，小鼠鼻腔上皮层中存在形态和功能上与M细胞相似的“呼吸M细胞”，平均每只小鼠鼻腔有200 ~ 300个“呼吸M细胞”，比NALT表面 M细胞数多5 ~ 10倍。在发生黏膜感染时，CD11c+DC会迁移到“呼吸M细胞”下方接受转运的抗原[12]。

在黏膜LP驻留着DC和巨噬细胞。这些细胞有的“定居”在上皮层下，捕获来自M细胞或上皮细胞转运的抗原；而有的长出跨上皮树突（transepithelial dendrite，TED），通过上皮细胞间隙伸入腔道抓捕抗原[13]。DC能够提呈和处理可溶性抗原和颗粒性抗原，并与CD4+T细胞发生抗原依赖性聚集，引发T和B细胞的增殖分化和一系列免疫反应[14]。与脾脏相比，黏膜相关淋巴组织中DC表达主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的水平约为前者的100倍，并被认为是T细胞依赖性IgA反应的主要诱导因子[15]。此外，研究发现DC在T细胞激活过程中和后来的B 细胞IgA 转型和分化中起关键性作用，DC的数量及功能对辅助性T（helper T，Th）细胞分化具有重要影响；而Th细胞的功能状态又直接关系到B细胞免疫应答的质量[6]。因此，DC在启动适应性免疫反应中发挥了重要的作用，其数量和功能状态可在一定程度上反映机体的免疫功能。

巨噬细胞表面存有多种受体，如免疫球蛋白受体、补体受体、多糖受体等[13]。这些受体可以特异性识别外源性颗粒，进而从周围摄取外源物质，故被认为是黏膜部位主要的APC。通常，腔内细菌或抗原被CX3CR1+巨噬细胞捕获后，细菌来源的物质或降解的抗原被转移到CD103+DC，并被提呈给T细胞而激活机体免疫应答[16]。DC和巨噬细胞既可摄取无害抗原，也可捕获有害的病原体。因此，它们在黏膜适应性免疫系统中具有耐受和免疫的双重作用[17]。

上皮细胞也参与抗原摄取。大多数物种（人、大鼠）的上皮细胞表达MHCⅡ类分子，并通过MHCⅡ类分子提呈抗原到邻近的APC或B细胞[18]。此外，在上皮细胞表面存在一些模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），可以通过网格蛋白介导内吞作用实现抗原的内吞和加工[19]。上皮层杯状细胞（goblet cell，GC）也参与抗原的摄取[20]。在稳定状态下，GC摄取食物来源的抗原，并特异性传递给耐受性CD103+DC，这一过程被称为杯状细胞相关抗原通路（goblet cell-associated antigen passage，GAP）。通过GAP获得抗原的CD103+DC可以诱导肠道免疫耐受并维持稳态[21]。因此，GAP被认为是诱导肠道免疫耐受的重要途径。

3 诱导黏膜免疫应答的挑战

尽管黏膜系统为疫苗接种提供了许多潜在的诱导位点，但由于多种物理或生理屏障的存在，黏膜疫苗的有效性仍然受到严重限制（见表1）。如肠道接种疫苗必须经历恶劣的胃肠道环境，包括pH梯度变化（1.2 ~ 8.6）和降解酶（蛋白酶、胰酶等）的攻击、黏液层的捕获等，这些因素极易导致抗原失活甚至被清除[22]。因此，对于口服疫苗，抗原必须在胃肠道中得到保护，以产生有效的免疫应答。肠道黏膜免疫中另一个挑战是免疫耐受。由于抗原在肠黏膜摄取效率较低，因而免疫耐受常被优先诱导发生，致使免疫细胞的活性和应答能力降低。这些问题极大阻碍了口服疫苗的开发。

表1 黏膜途径免疫的优势与挑战Table 1 Advantages and challenges of mucosal immunization

鼻腔黏膜免疫和阴道黏膜免疫也存在很多困难。鼻腔纤毛运动会将游离抗原立即从腔道中清除；鼻腔内少量的降解酶会破坏抗原表位；鼻黏膜部位的黏液层和上皮层导致抗原吸收困难，因此鼻腔疫苗的免疫反应常较低，需要免疫佐剂的辅助[4]。阴道黏膜由固有层、层状上皮和黏液层组成。黏液主要起润滑和防止阴道感染的作用。同时，阴道维持弱酸性（pH为4.0 ~ 5.0）环境来防御部分病原体侵袭。除此之外，阴道生理环境受到年龄、激素水平和月经周期的影响，这些因素均会导致阴道自然菌群、pH、阴道分泌液的变化，进而影响抗原在阴道的摄取，最终会导致阴道疫苗接种失败[23]。

近年来基于黏膜递药技术的研究发现，黏膜给药成功的关键是递药系统必须能同时克服黏液层及紧密连接上皮屏障[24]。黏液主要由黏蛋白和水等组成。黏蛋白含有大量糖基化的片段。这些片段呈高度负电性，带正电荷的粒子很容易被黏液捕获[25]。其次，黏蛋白疏水结构域聚集形成明显的疏水区，与疏水性颗粒具有高度亲和力，因此极大限制了传统疏水粒子在黏液中的迁移[25]。此外，黏蛋白纤维相互交联、互穿，形成多孔网状结构。微粒有效透过黏液，必须粒径小于其空间尺寸[25]。黏液层之后，紧密连接的上皮层进一步阻碍药物的摄取。研究显示，黏液渗透和上皮吸收的过程需要不同甚至矛盾的粒子表面性质[24]。疏水和正电性的表面性质有助于微粒的上皮吸收，但这些特性会导致微粒被黏液截留；有效的黏液渗透要求粒子表面呈亲水性和近中性，而这些性质又不利于细胞摄取[25]。因此，如何调节递药载体的性质，平衡其黏液扩散能力和上皮吸收效率成为一大挑战。此外，小鼠肠道内M细胞在FAE中比例约10%，而人类肠道中仅有5%[6]。肠黏膜上皮层虽然分布多种APC，但其数量较少，稳定状态下TED在小肠远端分布较少；而小肠近端几乎没有[20]。可见，通过上皮层APC转运实现抗原呈递的概率低，因而构建能够精确靶向黏膜APC的递送系统对提高抗原呈递极为重要。

4 黏膜疫苗的递送策略

流感、霍乱等病毒的黏膜疫苗被成功应用于人预防疾病后，黏膜疫苗的开发又燃起了新希望。研究人员通过不断实验，探索出不同的策略以克服黏膜免疫屏障，从而实现成功的疫苗接种。其中，基于生物材料和纳米技术制备的新型微粒载体展现了良好的发展前景。新型微粒能同时充当佐剂和递送载体。微粒封装策略对抗原具有理想的保护作用，并增加抗原在黏膜表面的浓度，进而显著提升抗原呈递效率；同时，微粒载体可以选择性地靶向到黏膜APC或淋巴组织，从而有效诱导机体黏膜免疫和系统性免疫响应。下文将重点讨论先进的递送策略在肠道、鼻腔、阴道黏膜疫苗开发中的应用。

4.1 主动靶向递送系统

随着黏膜部位抗原转运途径的阐明，新型纳米递送系统已经发展到靶向特定的APC或摄取途径，以实现抗原在黏膜部位精确的递送和在黏膜相关淋巴组织中累积。DC、巨噬细胞、M细胞和上皮细胞上的受体，以及相应的特异性配体已被用于构建各种主动靶向的疫苗载体，并极大促进了疫苗的免疫效果。下面介绍近年来黏膜免疫的主动靶向策略，以及这些靶向平台对抗原摄取和提呈的影响。

4.1.1 树突状细胞和巨噬细胞靶向DC和巨噬细胞表面表达多种受体，包括Toll样受体（toll-like receptor，TLR）、C凝 集 素 受 体（C-type lectin receptor，CLR）、新 生 儿Fc受 体（neonatal Fc receptor，FcRn）、整合素、甘露糖受体和清道夫受体等[26-27]。这些受体与外来分子的识别对抗原内吞、降解和提呈，以及DC和T细胞的激活都密切相关。甘露糖受体在DC和巨噬细胞表面高表达，其不仅能介导DC的内吞作用，还可通过TLR信号通路激活DC，进而将抗原呈递给CD4+和CD8+T细胞[28]。多项研究报道了甘露糖化的给药系统携带疫苗靶向黏膜DC，导致免疫反应显著增强。如甘露糖修饰的巯基化羟丙基甲基纤维素微球可以靶向呼吸道的APC，并通过刺激APC甘露糖受体增强毒素抗原ApxIIA在小鼠鼻黏膜的摄取，诱导高水平的黏膜IgA和血清IgG，使小鼠免受血清5型胸膜肺炎放线杆菌攻击[29]。与未修饰的纳米粒相比，甘露糖化纳米粒显示出更强的跨肠上皮转运能力和对PP区域APC的亲和力。基于甘露糖标记的壳聚糖（chitosan，CS）纳米粒口服递送沙门菌亚单位疫苗后，诱导TLR 1，TLR 2，TLR 3和TLR 7基因高表达，调节CD3+，CD8-，TCRγδ+和γδ T细胞比例，增强细胞和抗体反应，最终降低肉鸡肠道沙门菌的负荷[30]。DC也可以是耐受性疫苗的靶点。甘露糖修饰的纳米粒可以将热休克蛋白H6P靶向递送至糖尿病小鼠的肠道PP中，并使DC对H6P的吸收提高4.1倍。最终甘露糖修饰的H6P疫苗成功激活了抗原特异性T细胞耐受[31]。可见，甘露糖修饰疫苗载体在激活黏膜抗体反应或诱导免疫耐受方面均具有较大的潜能。开发DC靶向疫苗的一种新技术是使用DC靶向肽（DC-binding peptide，DCpep）。Sun等[32]报道了一种由12个氨基酸组成的DCpep（FYPSYHSTPQRP），该DCpep修饰的抗原能被DC高效摄取，同时通过TLR诱导NF-κB途径激活DC，并促进DC迁移。该研究表明，DCpep融合的血凝素抗原口服接种后可在脾脏中激活高水平的Th2（CD3+CD4+IL-4+）和Th1（CD3+CD4+IFN-γ+）细 胞，促 使 干 扰 素γ（interferon γ，IFN-γ）和白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）的分泌增加[32]。这些结果显示了DCpep融合抗原实现DC靶向的可行性和有效性，为增强黏膜疫苗的免疫原性提供了新方向。

4.1.2 M细胞靶向M细胞表面具有一系列特殊受体，包括糖蛋白2、膜联蛋白A5和肽聚糖识别蛋白-1等，与细胞吞噬外源物的活性相关[33]。研究者发现了M细胞表面受体识别的特异性配体，进而开发M细胞靶向载体。凝集素可以特异性结合小鼠M细胞顶端表达的α-L-海藻糖，因而成为M细胞靶向制剂常用的修饰配体[11]。动物实验结果显示，荆豆凝集素Ⅰ（Ulex europaeus agglutinin I，UEA I）是最有潜力的M细胞靶向配体。但遗憾的是，人类M细胞不表达UEA I所需的α-L-海藻糖受体[34]。近年来，新型植物凝集素被发现和应用。如番茄凝集素被成功地连接到纳米乳表面，用于传递癌症相关抗原，并通过口服给药途径诱导增强的毒性T淋巴细胞活性和强大的CD4+和CD8+T细胞反应，可以延缓肿瘤生长并减少肿瘤切除后的复发[35]。有研究报道，橙黄网胞盘菌凝集素（Aleuria aurantialectin，AAL）修饰的聚合物微粒通过高亲和性的受体-配体作用增强了M细胞的转胞吞能力[36]。这种M细胞靶向的聚合物微粒共递送精子蛋白17抗原和CpG-ODN佐剂，引发了体液和细胞免疫反应，进而阻止了卵巢肿瘤的生长[36]。虽然这些新的配体可有效地靶向小鼠M细胞，但它们靶向人类M细胞的能力还需要进一步验证。

另一种靶向M细胞的策略是利用M细胞靶向肽。Cho等[37]利用噬菌体展示技术发现了一种M细胞靶向肽CKSTHPLSC（CKS9）。CKS9表现出对M细胞高亲和力，能增加微粒在肠道向PP区域的靶向运输[38]。另一种M细胞靶向肽，甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（GRGDS），可以特异性地结合M细胞顶端表达的β1整合素。GRGDS偶联的β-葡聚糖微粒在保护口服抗原和M细胞靶向方面发挥了重要作用，显著提高了血清、肠道和黏液中的抗体浓度[39]。由此可见，M细胞靶向肽在促进抗原呈递和激活黏膜免疫反应上均具有巨大的潜力。

4.1.3 上皮细胞靶向上皮细胞在黏膜抗原摄取中发挥着不可忽视的作用。大分子抗原和惰性纳米粒可以通过受体介导的内吞作用被上皮细胞转运至黏膜固有层。已知的上皮细胞靶向配体包括凝集素、转铁蛋白、寡肽和单克隆抗体片段等[40]。利用这些配体完成疫苗向上皮细胞靶向递送，并增强黏膜疫苗免疫效率具有可行性。近年研究发现，来源于微生物表面的一些膜蛋白被用于修饰疫苗载体，以实现黏膜上皮细胞靶向。肠道微生物为了抵抗胃肠道中的酶降解和极端pH环境，在滋养体表面表达特异性的表面蛋白（variant-specific surface protein，VSP）进行自我保护。这些VSP被发现与肠上皮细胞相互作用并被内吞。此外，VSP显著上调DC表面CD40和CD86共刺激分子水平，能为黏膜疫苗提供理想的佐剂效果[41]。有研究将VSP成功用于修饰表达模型抗原的病毒样颗粒，并在小鼠经口免疫后产生了较高的lgG1，lgG2a和IgA抗体，促进脾脏T细胞分泌IFN-γ，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和IL-6，这些获得性免疫反应最终转化为对病毒感染的防御和对肿瘤生长的抑制作用[41]。另一项研究中，产气荚膜梭菌肠毒素的C-末端片段（C-CPE）能够靶向鼻相关淋巴组织上皮细胞表面的Cladin-4受体。肺炎球菌表面蛋白A与C-CPE 融合后的抗原经鼻免疫后，显著提升了鼻腔抗原特异性IgA反应[42]。

氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）是细菌F4菌毛特异性蛋白结合受体，在十二指肠上皮细胞上表达。近年来，APN靶向载体成为实现有效黏膜免疫的新途径。Baert等[43]报道了抗APN特异性抗体（IMM013）通过生物连接蛋白G定向偶联到酵母微粒表面，可以靶向递送抗原至空肠和回肠上皮细胞。Bakshi等[44]鉴定了APN靶向的可变重链抗体（variable domain of heavy-chain antibody，VHH）结构域。VHH结构域与小鼠IgG2a的Fc结构域融合，得到二聚融合体。该融合体与上皮细胞具有高亲和力，并能在APN表达细胞上高效摄取，且口服后可诱导高水平lgG和IgA应答，表明这种二聚融合体可作为靶向上皮细胞递送疫苗的工具。虽然上皮细胞靶向疫苗显示了较好的黏膜免疫应答能力，但上皮细胞靶向递送载体极易受到黏液层吸附、鼻纤毛运动等因素影响。因此，该策略还需要联合其他技术以在克服黏膜物理屏障的同时实现高效的靶向递送。

4.2 被动靶向递送系统

载体的理化特性，如表面电荷、大小、疏水性和亲水性可显著影响疫苗在黏膜部位的生物分布、摄取和免疫结果。研究人员观察到小于200 nm的纳米粒能够进入PP的圆顶区；更大的颗粒（1 µm）则分布在肠上皮的管腔侧[45]。PP中的DC和圆顶区中的CD11b+巨噬细胞倾向于小颗粒[46]。相反，较大的微粒（745 nm）通常被M细胞捕获[47]。在形状方面，纳米棒比纳米球更容易有效传输到MLN中[48]。经小鼠鼻内给药发现，粒径小于50 nm的纳米粒容易在鼻腔上皮吸收，并在黏膜下区域积累；100 nm粒子则会进入上呼吸道黏膜和嗅觉上皮细胞内[49]。科研人员可以根据这些信息建立有针对性的被动靶向递送系统。

巨噬细胞可以通过吞噬作用摄取大颗粒物质，如病原体和细胞碎片等。基于这一特性，研究人员将天然来源酵母囊壳（yeast-derived capsule，YC）作为载体靶向递送抗原至巨噬细胞。YC是一种天然来源的微胶囊，作为新型口服疫苗运载工具近年来受到了较多的关注。YC大小为2 ~ 4 μm，主要由β-1，3-葡聚糖组成。β-1，3-葡聚糖可被Dectin-1和iC3bCR 3优先识别，这2种受体在巨噬细胞和其他淋巴细胞表面高表达[50]。因此，YC可以同时基于大粒径和受体识别被巨噬细胞吞噬。Miao等[51]提出了一种基于YC的口服疫苗运输平台。其中，抗原卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）被包裹在铝金属有机框架（aluminum-based metal-organic framework，Al-MOF）纳米粒中，以避免抗原在胃肠道被水解。Al-MOF-OVA进一步封装到YC内被携带穿过M细胞进入PP，并迅速被巨噬细胞摄取，最终沿着淋巴管传递到MLN，免疫反应被激活。体内结果显示，YC封装的Al-MOF-OVA激活强有力的系统和黏膜免疫反应。相比之下，裸露的Al-MOF-OVA的免疫刺激性微乎其微，表明YC在口服运输抗原至肠黏膜系统过程中发挥着关键作用。YC具有多种优异性质，有助于其用于疫苗递送，包括：具有中空、多孔的胶囊结构，可装载大量的外来抗原，允许抗原和佐剂的共递送；具有较大的粒径，使其被巨噬细胞特异性摄取；可刺激上皮细胞产生早期炎症信号（IL-6，IL-8），促进免疫细胞聚集到黏膜部位，增加抗原摄取；具有天然的佐剂性质，能够促进DC和巨噬细胞成熟，诱导IFN-γ，IL-17，TNF-α等细胞因子产生，激活Th1和Th17免疫应答，以及抗原特异性毒性T淋巴细胞等[50-52]。可见，YC在黏膜疫苗递送中具有较大的开发潜力；但是YC的体内安全性以及对机体固有免疫的影响等都需要更深入的研究。

4.3 黏膜黏附性载体

黏附性聚合物通常具有较长的分子链，分子链上含有羧基、羟基、氨基和巯基等基团。聚合物通过这些基团与黏蛋白之间发生物理交联或共价键结合。因此，基于黏附性聚合物制备的粒子可以通过溶胀、静电吸附、疏水作用、氢键等机制黏附到黏膜表面[53]。如聚丙烯酸纳米粒可依赖于良好的溶胀性黏附到黏液层。由细菌纤维素/聚丙烯酸组成的水凝胶微粒（microparticle，MP）随胃肠液pH升高而逐渐溶胀，因而MP在胃中黏附最少，从十二指肠至结肠的黏附性则逐渐增加。这一特性协助MP携带抗原顺利通过胃，并促使抗原在肠黏膜有效释放。该MP用于口服递送乙肝抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）时，机体血清IgG抗体和黏膜IgA抗体水平显著升高[54]。

静电吸附是阳离子黏附材料的主要黏附机制，阳离子给药系统也是鼻黏膜免疫的首选载体。Yuki等[55]开发了一种阳离子纳米凝胶疫苗，其主要由一种含阳离子胆固醇的普鲁兰多糖构成。该疫苗鼻腔免疫可以有效激活呼吸道黏膜以及全身性的免疫反应，从而诱导对肺炎链球菌的双层保护。Vemireddy等[56]将聚己内酯末端连接酰肼，制成阳离子纳米粒包载重组登革热抗原，体外抗原共定位和交叉提呈实验表明，修饰的纳米粒可以通过酰肼上的游离胺产生的质子海绵效应，实现溶酶体逃逸，进而增加DC表面MHCⅠ类分子的表达。在BALB/c小鼠进行鼻内免疫后，修饰的纳米粒强烈刺激了机体免疫应答，尤其增强了细胞免疫应答。阳离子给药系统虽然在鼻黏膜免疫中成为首选，但其通常具有不同程度的毒性和副作用。此外，阳离子疫苗载体黏膜免疫后常常只激活体液免疫，而引起的细胞免疫不足。因此，优化阳离子给药系统，使其能够进一步提升细胞免疫应答，同时不产生毒性和副作用，成为后续研究中的一项重要工作。

传统的黏附聚合物，如壳聚糖（chitosan，CS）、透明质酸、海藻酸钠、聚乙烯亚胺等均可与黏蛋白的低聚糖链发生静电吸附或氢键作用，促进其在黏膜表面的黏附。CS具有强正电荷、免疫佐剂作用以及增强抗原吸收的优势，因此在黏膜免疫中应用广泛[57]。以CS或CS衍生物为黏附剂的处方在鼻腔免疫中显示了优异的免疫效果，提高了机体对日本乙型脑炎病毒[58]、流感病毒[59]以及BR-I基因型禽传染性支气管炎病毒[60]等病原体的黏膜防御作用。CS及其衍生物的理化性质会直接影响黏膜免疫反应。Fan等[61]设计了以2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan，HTCC）为基础的水凝胶作为H5N1疫苗的黏膜佐剂，并发现随着季铵化程度增加，HTCC正电荷增强，水凝胶在鼻腔黏膜的滞留时间延长，促进了抗原通过细胞旁路运输到鼻相关淋巴组织的频率。体内结果显示，高度季铵化的HTCC诱导了最高水平的IgG，IgG1和 IgG2a抗体[61]。由于传统聚合物形成的氢键或离子相互作用较弱，被认为只有中等的黏附能力；而当聚合物与黏蛋白之间形成共价键时，黏附能力会增强，更有利于黏膜部位抗原的摄取。新型的硫醇化聚合物可以与黏蛋白中丰富的半胱氨酸的亚结构域形成二硫键，特异性地附着在黏膜表面。实验表明，在猪肠黏膜内，硫醇化微粒的黏附性相比未修饰的微粒提高了2倍[62]。而一种基于硫醇化的Eudragit微球制备的疫苗口服免疫后，激活了脾脏中大量的IgG分泌细胞和肠PP中大量的IgA分泌细胞产生[63]。总体上，利用黏附作用延长微粒在黏膜的滞留时间，是提高黏膜疫苗免疫效果的有效途径。但不可忽视的是，黏液处于不断更新中，黏附性载体的滞留时间受黏液更新周期的限制，甚至会随着黏液的更新被清除。如何使黏附性微粒在滞留时间内实现快速的抗原释放和抗原呈递是需要进一步解决的问题。

4.4 黏液渗透微粒

有效的黏膜递送要求载体必须避免黏液的快速清除，并巧妙穿越黏液屏障到达上皮层。在众多微粒渗透黏液的实验中，研究者发现，快速渗透黏液要求粒子具备2个关键条件：一是微粒具有亲水性和近中性的表面，以避免物理吸附；二是微粒的粒径足够小，以避免黏蛋白网络的空间阻碍[64]。有研究者使用低相对分子质量（2 000 ~ 5 000）的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）包裹疏水粒子，获得一种表面电中性和亲水性的“黏液渗透粒子”（mucus permeating particle，MPP）[65]。研究显示，MPP粒径在100 ~ 500 nm时均普遍具有较好的黏液渗透能力；但对疏水性粒子来说，其粒径为100 nm也不能透过黏液。研究者进一步观察粒子在胃肠道中的轨迹，发现疏水性粒子在小鼠结肠直肠的黏液中聚集，而MPP向黏液深处扩散并均匀分布于肠上皮表面[65-66]。

目前，PEG或PEG衍生物是应用最多的“黏液惰性”材料。笔者所在团队合成了一种末端带羧基的麦穗状PEG衍生物（PEG-Suc），其带强负电荷并具有较好亲水性。我们将PEG-Suc与阳离子的穿膜肽聚-L-精氨酸R12、自组装形成表面近中性的纳米载体。该载体不仅实现了快速的黏液渗透，同时能将抗原运输到肠PP。该载体用于包载幽门螺杆菌候选疫苗（重组尿素酶B亚单位），口服免疫小鼠后引发了强烈的黏膜IgA抗体和高水平的CD4+/CD8+T细胞免疫反应，显著降低了幽门螺杆菌在胃黏膜的定殖[67]。另一项研究中，与PEG-Suc类似的PEG衍生物——APS包裹穿膜肽TAT修饰的重组腺病毒（rAd）粒子。APS提供亲水表面，使rAd粒子快速穿过阴道黏液，TAT提高rAd在上皮细胞的转染效率。将编码HIVgag的rAd-TAT-APS经阴道接种小鼠后，可显著增强HIVgag特异性的黏膜及全身免疫应答[68]。这些研究表明，将“黏液惰性”的PEG衍生物和细胞穿膜肽结合，可以实现有效的黏液穿透和上皮细胞摄取。PEG的相对分子质量和粒子表面PEG密度都会影响MPP的黏液渗透性，一般来说，PEG 相对分子质量越小（不高于5 000），粒子表面PEG密度越大，则越有利于粒子在黏液中扩散[69]。

除PEG外，其他生物材料也被尝试用于黏膜疫苗递送。如Pluronic F127、海藻酸钠、聚（甲基丙烯酸甲酯）-共-（丙烯酸甲酯）-共-（甲基丙烯酸）[poly(methyl methacrylate)-co-(methyl acrylate)-co-(methacrylic acid)，PMMMA]等。Shen等[70]构建了一种依赖海藻酸盐涂层的口服纳米凝胶。该凝胶将阳离子穿膜肽复合的DNA疫苗的黏液扩散能力提高了1.7倍，有效增加了体内抗原表达和免疫响应。PMMMA修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒不仅提高了抗原在胃肠道中的稳定性，还能有效渗透黏液实现肠黏膜部位高效的抗原吸收。该纳米粒口服递送链球菌表面B族蛋白抗原后，可在罗非鱼体内诱导强大的免疫反应，并成功预防无乳链球菌感染[71]。黏液渗透策略为新一代黏膜疫苗的开发带来了新的思路；但MPP或“黏液惰性”材料与黏液蛋白之间的相互作用机制尚不明确。因此，迫切需要新的研究技术或方法来探明相关的黏液渗透机制，从而合成更优异的“黏液惰性”材料并设计更智能的MPP来运输黏膜疫苗。

4.5 物理递送装置

科学家应用生物材料和纳米技术构建了不同的纳米粒、脂质体、乳剂等新型载体来提高黏膜疫苗的稳定性和递送效率，以增强免疫应答。这些策略已经成功改善了黏膜疫苗的免疫反应。然而，在大多数情况下，疫苗最终的保护效果仍然不尽如人意。最近，研究者开发了不同的物理递送装置用于疫苗递送，在黏膜免疫上取得了不错的效果。鼻腔喷雾给药装置是一种实用的递送方法，能够使疫苗更广泛分布到鼻黏膜，并富集到含DC和淋巴组织的区域，具有改善免疫应答的潜力。OptiNose公司推出双向呼吸动力技术平台（OptiNose™）用于全病毒流感液体疫苗的鼻腔递送，其主要依赖压力形成喷雾而完成鼻腔接种，结果显示，OptiNose™平台比传统的鼻喷雾剂和口服喷雾剂提供了更好的系统性免疫应答[72]。Kim等[73]利用一种无线电控制胶囊来提高腺病毒疫苗制剂的免疫效力。实验结果显示，该无线电控制系统能将腺病毒疫苗靶向定位到回肠。该部位具有较多的PP分布，因此可以诱导强大的黏膜及全身免疫应答。此外，Wei等[74]开发了一种仿生自推进微电机平台，用于口服递送抗病毒疫苗。该系统应用插入抗原的细胞膜包裹由镁制成的微粒，细胞膜外层进一步被黏附性CS和pH敏感的肠衣覆盖。所述制剂在肠衣保护下顺利通过胃环境。到达肠道后，包衣溶解，镁微粒接触肠液反应产生氢气，形成发动机平台，驱动抗原向肠黏膜推进，显著增强了抗原在黏膜的渗透和免疫刺激。该研究为仿生推动技术用于口服疫苗递送开辟了新思路。

由于阴道腔富有伸展性，容积大，故易放置大体积的给药装置。研究者探索了不同物理装置用于阴道黏膜免疫。McKay等[75]使用了一种新型阴道环装置。该装置包括1个硅胶弹性体，其中插入3个冻干的羟丙基甲基纤维素杆。每根杆内含有重组HIV-1 CN54gp140蛋白和R848佐剂。羟丙基甲基纤维素杆在阴道中溶蚀并逐渐释放抗原和佐剂，进而引发生殖器黏膜局部免疫反应，包括生殖器黏膜引流淋巴结中大量的抗原特异性B细胞，以及比IgG抗体高30倍的IgA抗体水平。近年来，微针递药技术蓬勃发展，其在药物递送和疫苗接种中均展示了广阔的开发前景。与其他方法相比，微针可以直接穿过黏膜屏障，从而准确将抗原递送至固有层，这避免了抗原被腔道分泌液稀释、蛋白酶降解和黏液捕获，可以准确控制疫苗实际进入体内的剂量。在一项研究中，甘露糖和PEG修饰的2种脂质体被同时载入生物可降解的微针。该微针穿透阴道黏液和鳞状上皮将纳米疫苗植入黏膜固有层。甘露糖化脂质体通过受体靶向被黏膜APC摄取，而PEG脂质体更多到达具有较高吞噬能力的黏膜相关淋巴结，这种多重递送的微针疫苗激活了高水平黏膜应答，同时建立了强大的Th1型免疫反应[76]。目前，已有多种物理装置被用于黏膜递送生物大分子药物。例如，可机械穿透上皮组织的微针注射器、可插入黏膜的自我定向毫米级涂药器、可溶解固体针胶囊装置（RaniPillTM）等[77-79]。这些先进的物理递送装置为黏膜疫苗接种提供了更多的替代平台，其可能加快新一代黏膜疫苗的开发。但物理装置给药常伴随黏膜上皮层紧密连接紊乱，从而导致在给药过程中黏膜部位的病原菌侵入机体。如何优化这一策略以提高疫苗的有效性，同时保证良好的安全性是物理递送装置实现临床转化的关键问题。

5 结语

相比注射疫苗，黏膜疫苗接种方便，能够避免针刺的痛苦，儿童接受性高；同时，黏膜疫苗可以制备成干粉、片剂或者胶囊剂，有可能实现无“冷链”的储存和运输，从而降低疫苗成本，改善偏远地区及贫穷国家获得疫苗的机会，对全球大流行性疾病的防治意义重大。尽管如此，开发新型有效的黏膜疫苗仍然是一项艰巨的任务。一方面，黏膜表面存在各种各样的生理屏障，这些屏障会干扰疫苗进入和激活MIS的能力，导致疫苗免疫原性降低和免疫能力更快下降。虽然制剂学家在疫苗递送技术上不断取得突破，提高了黏膜疫苗的接种效率和在动物模型上的成功率，但大多数项目都止步于模型动物上的研究，尚未进入到临床使用。目前不断有新的黏膜免疫策略出现，但尚缺乏可以克服所有挑战的策略。因此需要将新的理论和技术有机整合，以设计出有效实用的黏膜疫苗递送系统，使其能同时克服多重黏膜屏障，以改善抗原的摄取和提呈。另一方面，MIS具有明显的独特性。它的组成和免疫学特性不仅区别于全身性免疫系统，而且在不同黏膜部位之间也存在差异。黏膜表面环境以及黏膜与共生微生物群之间相互作用也会影响黏膜免疫细胞、淋巴组织的生成和维持，而目前研究人员对MIS的了解仍然极其有限。制剂学家和免疫学家之间需要更密切的合作，深入了解MIS的分子和细胞功能，进一步揭示纳米颗粒与免疫系统之间内在的相互作用，以及触发全身和黏膜免疫的机制，这些信息可能促使新的疫苗递送靶点被发现，进而推动新一代黏膜疫苗开发，为感染性疾病的防治带来希望。