固定酶底物法测定生活饮用水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌精密度分析

雷静 廖爽 乔茜茜 吕警

摘   要：总大肠菌群目前作为评价水质的一项指标，是反映水样是否受到粪便污染的指标。固定酶底物法是从美国引进的一种大肠杆菌新型检测方法。该方法采用酶底物法测定生活饮用水中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌，分析了不同浓度水样的精密度，低浓度水样的精密度为，1.6%、2.0%;中浓度水样的精密度为1.3%、1.8%;高浓度水样的精密度为2.0%、4.3%;阳性标准菌株的精密度均为0.86%。

关键词：酶底物法   总大肠菌群   大肠埃希氏菌   精密度

中图分类号：R123           文献标识码：A           文章编号：1672-3791（2022）07（b）-0000-00

Precision Analysis of Total Coliform group and Escherichia Coli in Drinking Water by Enzyme Substrate Method

LEI Jing1 LIAO Shuang1  QIAO Qianqian1 LYU Jing2*

（1.Xinjiang Changyuan Water Science Research Institute Co. Ltd.;2.Quality and Safety Testing Center of Urumqi Agricultural Products， Urumqi， XinJiang Uygur Autonomous Region， 830000 China）

Abstract： Total coliform group is currently used as an index to evaluate water quality， which is an indicator of whether the water sample is contaminated by feces. Enzyme substrate method is a new detection technology. This method uses enzyme substrate method to determine the total coliform group and Escherichia coli in drinking water， and analyzes the precision of different concentrations of water samples. The precision of low concentration of water samples is 1.6% and 2.0%. The precision of medium concentration water sample was 1.3% and 1.8%. The precision of high concentration water sample was 2.0% and 4.3%.The precision of positive standard strains was 0.86%.

Key Words： Enzyme substrate method; Total coliform; Escherichia coli; Precision

微生物常規检测指标为总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌。它们均可作为检验肠道致病菌的指示菌，是进行卫生学评价的重要内容。总大肠菌群是指一群在37 ℃培养24 h，能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。总大肠菌群目前作为评价水质的一项指标，是反映水样是否受到粪便污染的指标[2]。生活饮用水中针对大肠菌群、大肠埃希菌等的检测技术主要包括乳糖蛋白胨多管发酵法、滤膜法、固体酶底物法[3] ，其中多管发酵法为仲裁法[4]。固定酶底物法[5]是从美国引进我国的一种大肠杆菌检测方法，此方法简单、方便、快速、无培养基的制作与干扰等优点[6]。目前被美国、欧洲及大部分亚洲国家广泛应用于水中总大肠菌群、粪大肠菌群（耐热大肠菌群）及大肠埃希氏菌的检测。并通过美国EPA、《水与废水标准检测方法》以及我国《生活饮用水标准检验方法》认证[7]。

1    实验部分

1.1  材料与试剂

1.1.1试剂

在该实验中酶底物法所用酶底物法检测试剂 MMO-MUG培养基，无菌定量瓶（带100 mL刻度），51孔定量检测盘均购买于西安立科环保科技有限公司。

1.1.2仪器设备

隔水式恒温培养箱型号：GHP-9270，高压蒸汽灭菌器型号：LDZX-50KBS，程控定量封口机型号：LK-2010，手提式暗箱紫外分析仪型号：ZK-5。

1.1.3  标准菌株

阳性标准菌株：大肠埃希菌菌种号CMCC（B）44102 来源：南京便诊生物科技有限公司;阴性标准菌株：铜绿假单胞菌菌种号CICC 21636来源：中国工业菌种保藏中心。

1.2   试验方法

用无菌定量瓶量取100 mL水样（或稀释后水样），将2. 7 g M M O-M U G培养基加入待测水样中，使其完全溶解，混合均匀，然后将100 mL水样全部倒入51孔无菌定量盘内，用手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，用程控定量封口机封口，放入（37±1）℃培养箱中培养24 h（如显色不明显可延长至28 h）。将培养24 h后的定量盘取出观察，如孔格内水样变黄则说明该孔内含有大肠菌群，将培养24 h后的定量盘放置于波长366 nm 紫外光下照射，有荧光的孔格说明该孔内含有大肠埃希氏菌。最后计算变黄或变黄且有荧光的孔数对照酶底物法51孔最可能数（MPN）表，查出其代表的总大肠菌群或大肠埃希氏菌最可能数[8]。

2   结果与分析

2.1低浓度水样检测结果

如表2所示，通过预试验选择的中浓度水样进行了6次平行检测，样品稀释10倍，总大肠菌群、大肠埃希氏菌平行检测结果有了一些差异，精密度分别为1.3%、1.8%。

2.3  高浓度水样检测结果

如表3所示，通过预试验选择的高浓度水样进行了6次平行检测，样品稀释10 000倍，总大肠菌群、大肠埃希氏菌平行检测结果差异比低浓度和中浓度要大，精密度分别为2.0%、4.3%。

2.4阳性标准菌株菌悬液检测结果

如表4所示，将已复活复壮的阳性标准菌株配制成1麦氏比浊度的菌悬液，细菌约为3×108 cfu/mL，再将菌悬液稀释108倍再进6次平行行检测。精密度均为0.86%，因为该实验中所使用的阳性标准菌株为大肠埃希菌，可以作为总大肠菌群的阳性指示菌，故总大肠菌群、大肠埃希氏菌平行检测结果一致，精密度也一致。

2.5 陰性及空白对照

阴性对照试验参照阳性对照实验检测方法，经24 h培养后，阴性对照的51孔定量盘样品的颜色未发生变化，呈现阴性反应，该次样品测定结果有效。测定总大肠菌群、大肠埃希氏菌空白时，用无菌水代替试样参照阳性对照实验检测方法经24 h培养后的 51 孔定量盘均无任何颜色反应，检测结果满足实验要求。

3  结果与讨论

该次实验总大肠菌群精密度检测结果为 1.3%≤RSD≤2.0% ;大肠埃希氏菌精密度检测结果为 1.8%≤RSD≤4.3%。固定酶底物法操作方便，检测时间、培养时间都较短，而且不需要确认试验，能够对水样中的微生物污染情况进行准确检测和判断;能够同时检测大肠菌群和具有病原学意义的大肠埃希氏菌，特异性较高，灵敏高，可以很大程度降低实验过程中引入的污染，避免了二次污染的发生，对实验操作环境要求较低，不需要严格的无菌环境，对监测人员技术能力要求降低。酶底物法很好地弥补了传统检测方法在检测时间、灵敏度上的不足，可以很好地应用在生活饮用水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测，替代传统方法成为微生物检测的发展趋势。

参考文献

[4] 楼小平，林增飞.多管发酵法和酶底物法检测总大肠菌群的结果差异性[J].净水技术，2020，39（6）：14-17，37.

[5] 张晓华，高瑞红，王骥涛，等.酶底物法检测水中菌落总数的效果评价[J].山西医药杂志，2020，49（12）：1491-1492.

[6] 黄利美，黄锦婷，杨颖.酶底物法与多管发酵法检测大肠菌群的方法探讨[J].饮食保健，2018，5（1）：260.

[7]  杨晓冉，朱超，张付海，等.固定酶底物法测定水中粪大肠菌群的优点及影响因素[J].环境科学导刊，2017，36（5）：87-90.

[8] 罗匀.水中粪大肠菌群（耐热大肠菌群）两种检测方法的比较研究[J/OL].城市建设理论研究（电子版）：551-555[2013-06-15].https：//wenku.baidu.com/view/b6ad7bc019e8b8f67c1cb952？fr=xueshu.