粪便沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌分离培养方法研究

刘玉玲，黄焕宜，肖树荣，何国华，谢淑贤，黎青梅

阳江市人民医院检验科，广东 阳江 529500

食源性疾病是具有感染性质或中毒性质的一类疾病，是全球范围内分布最广泛、最常见的疾病之一，也是全球重要的公共卫生问题[1-2]。其中分别由沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌引起的非伤寒沙门菌病、志贺菌病和副溶血性弧菌病都属于我国细菌性食源性疾病监测名录中的病种。对于沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的检查，虽然免疫学和分子生物学等快速检测技术逐渐受到青睐，但仍存在成本较高以及无法区分细菌活性等缺点[3-5]。目前广大基层医院以及哨点医院仍然以金标准即传统的细菌培养方法为主，故提高粪便培养的检出率尤为重要。但粪便采样后的放置温度、放置时间以及使用增菌肉汤时的增菌时间关系到检验分析前和分析中的质量控制，与检出率密切相关。本文就粪便悬液放置温度、放置时间以及增菌肉汤增菌时间对沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌检出率的影响进行研究，以期优化粪便的分离培养方法，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 菌株 沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌各20株。其中标准菌株或室间质评菌株16株，来源于国家或广东省卫计委临床检验中心，包括肠炎沙门菌ATCC13076等6株沙门菌、福氏志贺菌ATCC51572等7株志贺菌、副溶血弧菌ATCC17802等3株副溶血弧菌。临床菌株44株，均经广东省疾控中心核准。包括沙门菌SE001等14株、志贺菌SH001等13株、副溶血弧菌VP001等17株。

1.2 试剂 沙门志贺肉汤、碱性蛋白胨水均购自广州市迪景微生物科技有限公司。沙门菌显色平板、弧菌显色平板购自郑州人福博赛生物技术有限责任公司。麦康凯琼脂平板购自郑州安图生物工程股份有限公司。

1.3 实验方法 对沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌菌株各设置以下三组实验。

1.3.1 放置温度实验 用灭菌生理盐水配置浓度约106cfu/mL[6-7]的菌悬液，再制备粪便悬液。吸取200μL菌悬液和0.5 g健康人的新鲜混合粪便混匀(不含目标病原菌)，再将粪便悬液平均分为两管，分别放置4℃2 h和25℃2 h，2 h时各接种一环(10μL)粪便悬液至相应选择性平板。含沙门菌粪便悬液接种沙门菌显色平板，含志贺菌粪便悬液接种麦康凯琼脂平板[8]，含副溶血弧菌粪便悬液接种弧菌显色平板。上述平板经35℃培养至18～24 h，挑取可疑菌落经生化及血清学鉴定。统计阴阳性样本数，计算检出率(检出率=阳性样本数/样本总数×100%)。

1.3.2 放置时间实验 按上述方法制备106cfu/mL的粪便悬液后，分别于常温放置0 h、2 h、3 h和6 h时接种相应平板，培养后挑取可疑菌落进行鉴定，计算检出率。

1.3.3 肉汤增菌时间实验 制备浓度约106cfu/mL的菌悬液后，吸取100μL加入到相应增菌肉汤(8 mL)中，再加入0.5 g的健康人粪便，混匀后放置35℃增菌培养。其中沙门菌、志贺菌用沙门志贺肉汤，副溶血弧菌用碱性蛋白胨水。并于增菌0 h、8 h、12 h和24 h时，各接种一环增菌肉汤至相应平板。培养后挑取可疑菌落进行鉴定，计算检出率，并记录阳性样本菌落形态特征。

1.4 统计学方法 应用Excel2007和SPSS23.0软件对数据进行分析，计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同放置温度粪便悬液的检出率比较 粪便悬液放置4℃2 h或25℃2 h，沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的检出率比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 不同放置温度粪便悬液的检出率比较(株)

2.2 不同放置时间粪便悬液的检出率变化趋势 粪便悬液常温放置0 h、2 h、3 h或6 h，沙门菌和副溶血弧菌的检出率均在85%以上，但志贺菌检出率随放置时间增加，检出率由75%(0 h)下降至5%(6 h)，见图1。

图1 粪便悬液常温放置0 h、2 h、3 h和6 h，沙门菌、志贺菌和副溶血孤菌检出率的变化趋势

2.3 不同肉汤增菌时间粪便悬液的检出率及阳性样本菌落特征 沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌增菌前(0 h)检出率均为0，增菌后检出率均有升高。增菌8 h、12 h和24 h，沙门菌的检出率分别为90%、90%和95%，志贺菌的检出率分别为50%、20%和5%。副溶血弧菌的检出率均为95%。分别含三种病原菌的粪便样本在相应平板上有独特的菌落特征，见表2。

表2 粪便悬液经肉汤增菌不同时间的沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌检出率及阳性样本菌落特征

3 讨论

在常规分离平板可检出的灵敏度浓度为106cfu/mL前提下[6-7]，放置温度实验结果显示，经4℃冷藏或25℃常温两种温度环境均放置2 h，对其活性的影响相当[8]。分析其原因可能与沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌对外界的抵抗力较强有关，因为沙门菌在水中可生存15 d，在-25℃环境下也可存活10个月以上[9]。志贺菌在冰块中可生存3个月[10]，在牛奶、果蔬中可生存1～2周。副溶血弧菌能在抹布和砧板上生存1个月以上，在海水中可存活47 d[11]。放置时间实验结果显示，沙门菌和副溶血弧菌的粪便标本6 h内接种，检出率可达85%以上。但是志贺菌检出率呈明显的下降趋势，放置6 h可由75%下降至5%，其原因可能是志贺菌的抵抗力较沙门菌和副溶血弧菌弱，容易被肠道正常菌群的代谢物抑制[12]，故其在粪便中的生存时间较为短暂。马新建等[13]也认为如果送检不及时志贺菌可能已死亡，因而难以培养出菌落，尚红等[14]也提出需培养志贺菌应采样后30 min内送检。

肉汤增菌时间实验表明粪便经增菌肉汤增菌至适宜时间接种选择性显色平板是提高沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌检出率的有效手段。使用沙门志贺肉汤增菌后接种沙门菌显色平板，筛查沙门菌效果显著，筛查志贺氏菌有效果。因为沙门志贺肉汤中的亚硒酸氢钠可以抑制革兰氏阳性细菌和部分阴性杆菌，让沙门菌和志贺菌繁殖生长起来。但其对沙门菌和志贺菌的适宜增菌时间有所不同，根据研究结果沙门菌的适宜增菌时间为8～24 h，而志贺菌的最佳增菌时间为8 h。因为增菌8 h后，志贺菌会被抑制或增菌效果不及杂菌，甚至出现个别杂菌优势生长而导致其检出率下降，这说明使用增菌肉汤时要把握好增菌时间。使用碱性蛋白胨水增菌8～24 h接种弧菌显色平板，筛查副溶血弧菌效果俱佳，是因为碱性蛋白胨水的高pH值环境特点，使大肠菌群和其他杂菌被部分或明显抑制，而嗜盐性的副溶血弧菌生长良好，增菌6～9 h即可形成菌膜，再加上弧菌显色平板能明显抑制非弧菌属细菌的生长，使杂菌生长为明显异于副溶血弧菌的细小菌落，从而达到很好的分离效果。研究还发现，使用增菌肉汤增菌0 h(未增菌)时，根据实验推算，三种病原菌的理论浓度为1.23×104cfu/mL，但其检出率均为0，可能是因为人类肠道菌群重量可达2 kg，共生着1013～1014个细菌，包含500～1 000种不同类型[15]，所以实验中加入的病原菌菌量远远低于粪便中正常肠道菌群数量，致使其无法通过平板分离出来。

同样的实验条件下，志贺菌三组实验的检出率均较低，这与多地报道的志贺菌的检出率较低相符[16-17]。除了志贺菌在粪便中抵抗力相对较低的原因外，还可能与麦康凯琼脂平板筛查志贺菌效果不佳有关。相对而言，实验中用于筛查沙门菌的沙门菌显色平板和筛查副溶血弧菌的弧菌显色平板均属于高选择性平板，能使目标菌呈现明显区别于其他肠道正常菌群的菌落特征，体现在显色、菌落大小以及抑制其他细菌生长的能力方面。但麦康凯琼脂平板为中等或弱选择性培养基，临床实验室用于筛查志贺菌，是因为志贺菌不发酵乳糖，在此培养基上为无色中等或小菌落。然而从颜色形态等视觉效果上志贺菌并不具有优势，在以下两种情况会出现假阴性：①粪便中志贺菌菌量较低或者分区划线的单个菌落较少时会被其他发酵乳糖的肠道杆菌粉红色菌落覆盖或与之融合。②宋内氏志贺菌在麦康凯琼脂平板上存在光滑型和粗糙型两种菌落[8，14]，因部分菌株可迟缓发酵乳糖从而在麦康凯琼脂平板上呈现浅粉色，而非常见的无色透明圆形菌落。因此可认为，单独使用麦康凯琼脂平板筛查志贺菌效果不佳，应改用或联合使用其他选择性平板，如木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)、琼脂(HE)平板等[12]。此外，临床微生物人员应具备分区划线获得较多单个菌落的能力和过硬的病原菌形态甄别能力。

综上所述，可经以下途径优化粪便的分离培养方法，提高沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌检出率：①粪便经专用增菌肉汤增菌至适宜时间接种选择性显色平板。筛查沙门菌可使用沙门志贺肉汤增菌8～24 h接种沙门显色平板。筛查副溶血弧菌可使用碱性蛋白胨水增菌8～24 h接种弧菌显色平板。②粪便采样后及时接种，否则4℃或25℃放置。如未经增菌，6 h内直接接种选择性平板，适用于沙门菌和副溶血弧菌菌量大于106cfu/mL的粪便样本。③单独使用麦康凯琼脂平板筛查志贺菌效果不佳，可用沙门志贺肉汤增菌8 h改用或联合接种其他选择性平板。