抗黏液蛋白1单抗偶联吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒对胰腺癌模型动物抑瘤作用的实验研究

张林 侯艳红 李春梅 刘浩润

中国人民解放军总医院第八医学中心消化内科，北京 100091

【提要】 采用乳化聚合法制备负载吉西他滨(GEM)的纳米微球(GEM-PBCA-NP)，应用化学交联法将抗黏液蛋白1(MUC1)单抗偶联GEM-PBCA-NP。采用皮下种植法建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，并随机分为MUC1-GEM-PBCA-NP组、GEM-PBCA-NP组、GEM组、单纯纳米颗粒组(PBCA-NP组)和对照组。结果显示，MUC1-GEM-PBCA-NP组裸鼠移植肿瘤的抑制率显著高于其他各组，治疗结束时的移植肿瘤重量显著低于其他各组。提示MUC1-GEM-PBCA-NP对裸鼠移植肿瘤具有良好的抑制生长作用。

胰腺癌是严重威胁国人健康与生命的一种恶性肿瘤，近年来发病率及死亡率呈快速上升的趋势。胰腺癌早期无明显症状，难以发现，确诊时大多为进展期，又缺乏有效的治疗手段，故预后极差[1-2]。因此针对晚期胰腺癌有效而不良反应低的治疗方法是目前研究的热点。本课题组先期研究以抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)作为靶点，将抗EGFR抗体偶联到载吉西他滨聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球(EGFR-GEM-PBCA-NP)，用于治疗胰腺癌移植瘤，结果显示有一定的靶向性和抑瘤作用，但效果不甚理想[3-4]。近年来黏液蛋白1(mucin 1，MUC1)作为新的靶点进入了研究者的视野。因MUC1在胰腺癌组织的表达率高达80%[5-6]， 故本课题组将抗MUC1单克隆抗体偶联到GEM-PBCA-NP，通过胰腺癌PANC1细胞株的体外实验，显示MUC1-GEM-PBCA-NP能抑制癌细胞的增殖[7]。本研究进一步行MUC1-GEM-PBCA-NP治疗胰腺癌的动物体内实验。

一、材料与方法

1．MUC1-GEM-PBCA-NP制备：MUC1单抗购自Abnova公司。GEM-PBCA-NP的制备参考李春梅等[3]方法。将GEM-PBCA-NP与抗MUC1单克隆抗体完全混合溶于pH7.4的SBF溶液, 低速磁力搅拌下按一定比例加入碳二亚胺溶液, 混均后离心取沉淀。超声分散沉淀物后，用去离子水洗涤4遍，冷冻干燥获取抗MUC1单抗与GEM-PBCA-NP的交联物(MUC1-GEM-PBCA-NP)。应用激光散射粒度分析仪(Zeta sizer Nano ZS90型，英国马尔文公司)观察微球粒的大小及抗体的分布，计算包封率及载药率。包封率=纳米微球粒实际载药量/总投药量×100%；载药率=纳米微球粒实际载药量/称取的纳米微球粒质量×100%。

2．体内抑瘤实验：人胰腺癌细胞株PANC1由北京富众科技发展有限公司提供,常规复苏、培养、传代。BALB/c裸鼠45只，5～6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。参考马琳等[8]及李春梅等[4]方法制备荷瘤裸鼠模型，即取0.2 ml(6×107/ml)PANC1细胞悬液注射于裸鼠右侧腋部皮下，待瘤体最大径>0.5 cm(需7～10 d)为建模成功。共39只裸鼠成功建模，按数字表法将其中35只随机分为5组，每组7只。MUC1-GEM-PBCA-NP组，经尾静脉注射2.5 mg/kg吉西他滨(gemcita bine, GEM)等药剂量的MUC1-GEM-PBCA-NP；GEM-PBCA-NP组，经尾静脉注射等药剂量GEM-PBCA-NP；GEM组：经尾静脉注射GEM 2.5 mg/kg；单纯纳米颗粒组(PBCA-NP组)，经尾静脉注射等容积PBCA-NP；对照组，经尾静脉注射等容积生理盐水。每5 d重复治疗1次，每3 d测量1次肿瘤长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V)，V=a×b2/2。实验开始后第15天及第30天上IVIS·Lumina LT小动物活体成像系统(美国PerkinElmer)行活体生物发光检测成像并记录，生物发光实验参考王剑超等[9]方法。第30天处死裸鼠，剥离瘤体称重，计算抑瘤率。抑瘤率=[(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重]×100%。

二、结果

1．各组纳米粒子电镜下观察结果：MUC1-GEM-PBCA-NP组电镜下观察制备的纳米颗粒形态为光滑的球形，药物GEM细颗粒均匀地分散在聚合物基质中。GEM-PBCA-NP组和MUC1-GEMPBCA-NP组纳米粒大小分别为(49.62±6.17)nm和(58.14±6.44)nm。 GEM-PBCA-NP组和MUC1-GEM-PBCA-NP组纳米粒中GEM的包封率分别为(44.52±4.22)%、(47.19±3.63)%，载药量分别为(7.24±0.71)%、(6.85±0.56)%。表面修饰后纳米粒子并无明显变化，表明MUC1-GEM-PBCA-NP靶向载药纳米粒子制备成功。

2．MUC1-GEM-PBCA-NP1的裸鼠移植瘤抑瘤效果：治疗后30 d，MUC1-GEM-PBCA-NP组、GEM-PBCA-NP组、GEM组裸鼠的抑瘤率显著高于PBCA-NP组及对照组，MUC1-GEM-PBCA-NP组抑瘤率又显著高于GEM-PBCA-NP组、GEM组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而GEM-PBCA-NP组与GEM组抑瘤率差异无统计学意义(图1，表1)。

图1 各组裸鼠移植瘤的生长曲线

3．裸鼠移植肿瘤的光子量变化：MUC1-GEM-PBCA-NP组、GEM-PBCA-NP组、GEM组、PBCA-NP组及对照组治疗前移植瘤基础光子量均值分别为3.44±0.56、4.01±0.59、3.79±0.61、4.20±0.62、3.64±0.56，各组间差异均无统计学意义；治疗第15天移植瘤光子量均值分别为7.21±0.76、14.48±1.34、13.77±1.52、27.25±3.56、29.52±2.43，其中MUC1-GEM-PBCA-NP组显著低于其余各组(P值均<0.05，图2)，GEM-PBCA-NP组和GEM组又显著低于PBCA-NP组和对照组(P值均<0.05)，其余组间差异均无统计学意义；治疗第30天移植瘤光子量均值分别为9.46±0.89、17.27±1.89、18.43±1.98、36.15±4.98、38.382±4.22，其中MUC1-GEM-PBCA-NP组显著低于其余各组(P值均<0.05)，GEM-PBCA-NP组和GEM组也显著低于PBCA-NP组和对照组(P值均<0.05)，其余组间差异均无统计学意义。MUC1-GEM-PBCA-NP组给药第15天和第30天的移植瘤光子抑制率分别为67.27%和74.29%。

图2 治疗15 d时MUC1-GEM-PBCA-NP组(2A)、GEM-PBCA-NP组(2B)、GEM组(2C)、PBCA-NP组(2D)及对照组(2E)裸鼠移植瘤的肿瘤生物活体发光成像图

讨论近年来纳米载药系统成为一个主要的研究方向。国内外已经有采用纳米载药系统进行胰腺癌治疗的研究[10]，如金纳米粒子、碳纳米管、纳米二氧化硅和超顺磁性、氧化铁纳米粒子等无机纳米粒子以及白蛋白纳米粒子、壳聚糖纳米粒子等有机纳米粒子在胰腺癌诊断、治疗方面已取得一定成绩[11]，但仍有诸多问题需进一步解决，其中分子靶点问题是一个研究热点。MUC是一类大分子量糖蛋白，在正常生理状态下，MUC的表达具有明确的组织特异性和时间特异性[12]。在病理状态下，MUC表达异常是许多疾病及肿瘤的特征，尤其在胰腺癌组织中，MUC1异常表达已被研究证实。已有研究以MUC1作为引导纳米粒子的靶向分子，显示在胰腺癌中具有良好的导向作用。张重捷等[13]制备了抗MUC1单克隆抗体靶向修饰的探针超顺磁纳米颗粒，体内实验结果显示，该纳米颗粒可以选择性地积聚在裸鼠移植瘤内，可作为磁共振检查时特异性显影剂使用，提示MUC1作为靶点治疗胰腺癌的可行性。因此本研究也采用抗MUC1单克隆抗体靶向修饰载GEM纳米微粒的类似策略。

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒(PBCA-NP)作为药物载体具有颗粒大小适中，可避免内皮网状系统吞噬，快速分布于组织，具有优良的药物缓释作用, 本课题组前期的体外细胞实验已显示其良好的载药及药物释放作用[14-15]。本研究结果显示，MUC1-GEM-PBCA-NP对于裸鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用明显优于无抗体偶联的GEM-PBCA-NP及GEM直接的药物作用，而GEM-PBCA-NP与GEM的抑制作用未见明显差异，提示抗MUC1单抗对于载GEM纳米微粒的动物体内导向作用较为显著，与本课题组前期的体外实验结果一致。本研究通过肿瘤生长曲线、肿瘤体重计算及活体生物发光显像等方法评估MUC1-GEM-PBCA-NP的抑瘤效果，各方法总体结果基本一致，其中以肿瘤体重计算的MUC1-GEM-PBCA-NP组抑瘤率略低于活体生物发光光子量计算的抑瘤率，但差异无统计学意义，初步证实了抗MUC1单抗修饰的载GEM纳米微球在动物模型体内能够通过血行转运，克服内皮网状系统吞噬等诸多不利因素的影响而到达胰腺癌移植瘤组织内，从而产生良好的抑制肿瘤生长的作用。

本研究是以模型动物为基础的前临床水平研究，结果具有局限性。纳米微粒在人体内的情况更为复杂，人体的组织结构、血管淋巴管转运、内皮网状系统以及更为重要的人体免疫系统作用都与免疫缺陷的裸鼠有很大不同。因此对纳米微粒的优化和在更为高等动物模型体内实验研究将是下一步研究的工作重点。

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