不同城市PM2.5致小鼠肝脏纤维化的效应差异研究

闫志鹏,李舒月,邢颀颂,南 楠,秦国华,桑 楠

不同城市PM2.5致小鼠肝脏纤维化的效应差异研究

闫志鹏,李舒月,邢颀颂,南 楠,秦国华*,桑 楠

(山西大学环境与资源学院,山西 太原 030006)

为阐明PM2.5诱发肝脏纤维化的潜在机制以及导致这种不良效应的主要组分,本研究以采自我国太原、北京、杭州和广州市的PM2.5暴露10月龄C57BL/6雌性小鼠4周后,利用组织切片染色,荧光定量PCR(qRT-PCR)以及Western blot 技术检测小鼠肝脏纤维化的发生,并采用皮尔森相关系数法分析不同城市PM2.5暴露组小鼠肝脏纤维化相关基因表达水平与各城市典型化学组分的线性相关关系.结果发现,与对照组相比,太原组和杭州组小鼠肝脏脏器系数显著降低;太原组小鼠肝脏胶原沉积面积显著增加,肝脏纤维化相关基因(和)的转录水平显著升高,并且也仅有太原组PM2.5暴露诱导了小鼠肝脏蛋白的显著增高,而其他城市PM2.5暴露组并未见上述纤维化相关因子的显著变化.相关性分析结果显示,Cr、Mn、Mo、Cs、Pb、Bi、U和Fe等金属组分与和Col3a1的mRNA表达呈显著正相关,除NA、AC及BaP外其余15种多环芳烃均与表达显著相关,18种PAHs之和与表达显著相关.上述结果表明,PM2.5暴露可导致小鼠肝脏纤维化的发生,其中太原市PM2.5诱导肝脏纤维化发生最为显著,TGF-β及其通路中相关信号分子在介导PM2.5诱发肝脏纤维化发生中发挥了重要作用,Cr、Mn、Mo、Cs、Pb、Bi、U、Fe及PAHs很可能是细颗粒物暴露导致小鼠肝脏纤维化的关键毒性组分.

PM2.5；肝脏；纤维化；关键组分

据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年因PM2.5暴露导致的过早死亡人数约为300万[1-2].此外,PM2.5暴露还与心肺疾病、脑血管疾病和肺癌等疾病的发病率增加有关[3].统计数据表明截至目前仍有超过80%的人生活在空气质量标准超过WHO限值的地区[4].但是,WHO及大多数国家环境部门在制定空气污染物限值标准时,通常是假定单位质量浓度的毒性强度相等,基于风险估算值(每μg/m3)来估算大气PM2.5暴露对人口健康的影响,然而,近年来流行病学与毒理学研究均发现在不同地域暴露于相同质量浓度的PM2.5可能导致程度不一的健康后果[5].由此可见,PM2.5污染仍是目前全球范围内一个严重的公共卫生问题,研究PM2.5对于人体暴露的区域毒性差异具有重要意义.

越来越多的流行病学证据表明,PM2.5污染可能是导致全球肝损伤(包括非酒精性脂肪肝、肝纤维化和肝癌等)和代谢综合征发病率上升的最重要环境因素之一[6-7].肝纤维化是多种肝病的常见病理过程,其特征是肝脏正常组织结构中胶原纤维过量积聚、肝脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变[8].基于实验动物模型的研究发现,不论是在美国哥伦布还是我国新乡市,吸入高浓度环境PM2.5均可诱导小鼠肝组织纤维化,并且高脂饮食加重了这种不良反应[9-10].现有研究认为,外源物质通过激活转化生长因子β()信号,促进磷酸化,进而促进、合成,增加胶原蛋白和的表达是肝脏纤维化发生的一条经典通路[8],但TGF-β及其通路中相关信号分子是否介导PM2.5诱发肝脏纤维化发生及机制鲜见报道.

虽然来自不同地区的研究均发现PM2.5可导致动物肝脏胶原沉积增加/纤维化,然而这些不良影响和危害程度不同[9-10],另有研究显示,国外不同区域内PM2.5浓度升高相同值对肝脏疾病发病率的风险各异[11].我国首个研究PM2.5长期暴露与NAFLD风险关联的前瞻性队列结果表明:同一地区生活在离交通主干道地区越近的人群,肝脏脂肪累积越明显,NAFLD发病率越高[12].造成上述差异的根本原因可能与PM2.5所负载的化学成分和来源有关[12].目前文献关于PM2.5导致肝脏纤维化的发生虽有报道,对不同地区PM2.5样本中的重要毒性组分的研究也多有测定,然而某些毒性组分在细颗粒物中所占比例高并不意味着其对整体复合毒性的贡献大,针对PM2.5中究竟是哪些组分可诱导肝脏纤维化还不清楚.

为此,本研究通过采集我国重点监控的京津冀及周边地区、长江三角洲和珠江三角洲等大气污染防治重点区域的四个城市(太原,北京,杭州和广州)PM2.5样本,将其暴露于10月龄雌性小鼠,以肝脏纤维化标志物的表达变化为效应终点,同PM2.5中典型化学组分进行统计学关联,初步判定PM2.5中可能诱导肝脏纤维化的主要毒性组分,以期为大气污染的风险评估和防治提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

雌性C57BL/6 小鼠购于南京君科生物工程有限公司;总RNA提取试剂Trizol,反转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒均购于Takara公司;引物由上海Invirtrogen有限公司合成;10%的中性甲醛溶液购于武汉赛维尔生物科技有限公司.

1.2 PM2.5样本采集与染毒液制备

采用TH-150CⅢ型中流量大气采样器于2017年11月至2018年1月同时在我国四个城市采集大气中的PM2.5.采样点分别设在太原(山西大学),北京(国家纳米科学技术中心),杭州(浙江工业大学)和广州(中山大学).采样流量设定为100L/min,采样时间设定为22h/d,将PM2.5收集在石英滤膜上.采集完成后,将整个采样期间获得的石英滤膜剪碎浸泡在超纯水中,经超声振荡、纱布过滤掉大块残渣后制成PM2.5悬浊液,然后将其真空冷冻干燥为PM2.5干粉.暴露小鼠前称取一定量的PM2.5干粉, 用生理盐水配制成等质量浓度的PM2.5悬浊液.所采集PM2.5的典型化学组分(金属和多环芳烃)信息参见本课题组前期文献[13].

1.3 小鼠分组、染毒与取材

选10月龄SPF级雌性C57BL/6小鼠45只,适应性喂养1周后按体重随机分为对照、太原、北京、杭州、广州5组,每组9只.参考课题组前期染毒剂量[14],采用咽后壁滴注法给不同城市组小鼠滴注3mg/kg(以体重(BW)计)的PM2.5悬浊液,对照组小鼠滴注等量生理盐水,隔天滴注一次,持续染毒4 周.实验期间观察小鼠的精神状况, 日常行为以及体重变化等情况.

PM2.5持续暴露4周后处死小鼠,快速摘取小鼠肝脏,生理盐水漂洗、拭干组织表面浮水后称重.取肝脏大叶边缘组织用10%的中性甲醛溶液固定,剩余组织用液氮速冻后转入-80℃冰箱冻存.

1.4 组织切片的制备、染色与观察

取10%中性甲醛固定的肝脏组织,制备常规石蜡切片,采用苏木素-伊红(H&E) 和Masson三色法染色,显微镜观察并拍照,并使用 Image-Pro Plus软件计算胶原沉积(蓝色)面积占总面积百分比,定量表征肝纤维化程度[15].

1.5 总RNA提取及实时荧光定量PCR

采用Trizol提取小鼠肝脏组织总RNA.使用反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA,参照试剂说明建立qRT-PCR反应体系检测目的基因的表达.使用梯度稀释的cDNA为模板做每个基因的标准曲线,得到每个样品的目的基因及内参基因GAPDH的相对数值,先计算每个样品的目的基因/内参基因GAPDH的比值,再计算各处理组与对照组之间目的基因/内参基因比值的比值[15].引物序列见表1.

表1 实时荧光定量PCR中所用引物序列

1.6 蛋白免疫印迹分析(Western-blot)

用预冷蛋白裂解液从肝脏中提取蛋白质,经 SDS-PAGE凝胶电泳、转膜等步骤将目的蛋白电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,随后经封闭、一抗孵育、二抗孵育、蛋白显影等步骤对目的蛋白的表达进行定量检测[15].目的蛋白与β-actin光密度比值即为目的蛋白的相对表达含量.

1.7 数据统计与分析

本研究中数据均以平均值±标准误表示.实验结果采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法.用皮尔森相关系数(Pearson)法分析目的基因转录水平变化与PM2.5典型化学组分质量浓度的相关性[13].< 0.05,用*表示,<0.01,用**表示.

2 结果与分析

2.1 不同城市PM2.5暴露对小鼠一般体征和肝脏系数的影响

实验期间各组小鼠行为活动无明显异常,饮食与排便正常,生长状态良好,无死亡.本课题组前期报道显示,经不同城市PM2.5暴露后各组小鼠间体重无显著差异[16].取肝脏组织称重并计算脏器系数发现,与对照组相比,太原组和杭州组小鼠肝脏脏器系数显著降低,而北京组和广州组则无显著变化(图1).该结果提示太原市和杭州市PM2.5暴露可能对小鼠肝脏产生了一定的毒性作用,引发实验动物的肝脏萎缩.

图1 不同城市PM2.5暴露对对小鼠肝脏系数的影响

2.2 不同城市PM2.5暴露对小鼠肝脏组织病理变化的影响

图2 不同城市PM2.5暴露对小鼠肝脏组织病理变化的影响

采用H&E染色法观察不同城市PM2.5暴露对小鼠肝脏组织学的改变,结果显示,对照组小鼠肝脏组织结构正常,肝细胞以中央静脉为中心呈辐射状有序分布;太原组小鼠肝脏虽然也以中央静脉为中心呈辐射状分布,但汇管区结构不明显,疑似静脉管周有胶原纤维散在.北京组和杭州组小鼠肝组织未呈明显异常病理变化.而广州组小鼠可见轻度炎性细胞浸润(黄色箭头)、肝细胞空泡化和肝索紊乱(图2).

图3 Masson染色胶原沉积面积量化结果

对肝脏进行Masson染色通过评估胶原沉积表征小鼠肝脏的纤维化程度.如图2显示,对照组小鼠的胶原分布正常且很少,北京组、杭州组和广州组小鼠肝组织胶原沉积也不明显,仅有太原组肝组织存在广泛的胶原沉积(黑色箭头,中央静脉周围蓝色视野).纤维化区域的定量结果(图3)显示,太原组小鼠肝脏胶原沉积比例达对照组的2.62倍,提示太原市PM2.5可引起肝脏胶原沉积与纤维化反应.

2.3 不同城市PM2.5暴露对小鼠肝脏纤维化相关基因转录水平和蛋白表达的影响

对肝脏中的主要结构胶原蛋白和,促纤维化标志物以及纤维化相关基因的mRNA 水平进行检测,结果显示:太原组小鼠肝脏中、、和的mRNA水平均显著高于对照组(<0.05),变化倍数分别为2.64、2.37、1.49和2.24,而北京、杭州和广州组小鼠肝脏中上述4种基因的表达无明显变化(图4).基于上述结果,我们进一步比较了转录水平变化最明显的基因在小鼠肝脏中蛋白表达水平,发现仅有太原组PM2.5暴露诱导了小鼠肝脏I型胶原蛋白的表达上升(图5),这些表明太原市PM2.5可诱导小鼠肝组织中纤维化相关因子的转录与表达水平的显著上升,导致小鼠肝脏纤维化发生.

图4 不同城市PM2.5暴露对小鼠肝脏纤维化相关基因转录水平的影响

2.4 PM2.5中典型化学组分与小鼠肝脏纤维化相关基因转录水平的关联分析

3 讨论

已有大量研究证实了PM2.5暴露对人群呼吸系统、循环系统等的健康危害.肝脏作为重要的代谢和解毒器官,也易受到外来物质的影响.肝纤维化是一种肝脏应对外来有毒物质胁迫而产生的可逆性伤口愈合反应[17],肝内结缔组织增生与沉积以及纤维瘢痕的形成是肝纤维化的典型表现[18-19].据报道,PM2.5是诱发肝纤维化的重要危险因素,暴露于PM2.5的动物可观察到肝组织学有明显的窦周纤维化,肝纤维化标志物表达明显上调[9]等病理现象.但由于地形特征、气象条件以及污染排放源的不同,不同来源、时空范围的PM2.5毒性存在着巨大的差异.为此,我们采集我国重点监控的京津冀及周边地区、长江三角洲和珠江三角洲等大气污染防治重点区域的四个城市的PM2.5样本,在测定其典型化学组分的基础上,探讨其对小鼠肝脏纤维化的效应差异原因,为初步判定PM2.5中可能诱导肝脏纤维化的主要毒性组分提供数据支撑.

PM2.5暴露引起小鼠肝脏的脏器系数和病理学改变存在城市差异性.脏器系数可能是体现某些受试物毒性的敏感指标,石蜡切片H&E染色是检查器官形态结构变化的最常用方式.本研究发现,太原市PM2.5处理组小鼠和杭州市PM2.5处理组小鼠肝脏脏器系数显著降低,提示小鼠肝脏已发生一定的病变,但通过组织切片观察、分子生物学检测发现仅太原市PM2.5诱导了小鼠明显的肝脏纤维化,杭州市PM2.5并没有产生类似的效应.此外,H&E染色发现仅有广州组小鼠肝脏存在轻度炎性细胞浸润、细胞空泡化等病理特征.本课题组前期研究发现,太原市PM2.5中重金属和多环芳烃组分浓度远远高于广州市和杭州市,且太原市PM2.5对小鼠心脏功能、心肌肥大等方面的影响较其他城市来说较大[20],而广州市PM2.5诱发小鼠肝脏脂肪变性效应发生的能力最强(数据未发表);杭州市PM2.5处理组小鼠肝脏系数的降低表明杭州市PM2.5对小鼠肝脏存在明显的毒性效应,但毒理终点尚未明确.因此我们认为,PM2.5各组分间相互关系的复杂性以及生物体对不同毒性组分组合的敏感性是造成PM2.5生物毒性的差异性的根本原因,太原市PM2.5暴露组小鼠肝脏系数显著下降以及出现明显的纤维化表型可能与PM2.5所含成分有着直接关系.

PM2.5暴露引起小鼠肝脏纤维化相关基因表达改变存在城市差异性.研究表明,肝脏纤维化是一个涉及肝脏巨噬细胞(Kupffer细胞)、肝贮脂细胞(Ito细胞)、肝星状细胞(HSC细胞)以及细胞外基质等多种特殊细胞类型协调作用的复杂过程[21].当肝脏损伤发生损伤时,ITO细胞可被激活并分化为肌成纤维细胞,在此过程中,转化生长因子-β(TGF-β)促进肌成纤维细胞的分化产生细胞外基质蛋白,特别是胶原蛋白(以Col1a1和Col 3a1型胶原为主)的产生.肝脏纤维化的发生是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果,细胞外基质的积聚是导致肝脏纤维化的关键病理生理因素[17-18].基质金属蛋白酶(MMPs)是一类重要的调节细胞外基质水解蛋白水解酶,在肝纤维化的发生发展过程中也发挥着着关键作用. MMP2是MMP家族重要成员之一,已证实其异常表达与肝脏纤维化密切相关[22-23].本研究结果显示太原组小鼠肝脏中、、和的mRNA水平均显著升高,而北京、杭州和广州组小鼠肝脏中上述4种基因的表达均无明显变化. Western blotting检测的表达水平变化也进一步证实了太原市PM2.5诱发小鼠肝组织胶原沉积的结果.同样地,Li等人也发现太原市冬季PM2.5暴露导致了大鼠肝组织中、和的mRNA和蛋白表达显著上调,炎症加重[24].基于上述结果,推测PM2.5诱导肝脏纤维化效应存在组分依赖性,太原市PM2.5中可能存在一些具有较强的诱导肝脏纤维化的组分,深入筛选与识别关键致毒组分具有重要意义.

PM2.5致小鼠肝脏纤维化的地区间效应差异与其负载的化学组分特征密切相关不同区域间PM2.5导致的毒性效应与健康结局不同,可能反映了区域间污染源以及大气演化过程的差异,从而决定了区域间PM2.5化学成分的差异.我们前期发现[13],太原市冬季PM2.5中Cr、Mn、Cs、Pb、Bi、U和Fe元素的含量均大大高于其他3个城市.太原市PM2.5中的∑PAH浓度一年四季均最高(分别是北京2～10倍,杭州12～129倍,广州4～15倍).我们推测,一方面,太原市的空气污染特征已逐渐从典型的煤烟型污染演变为煤烟和机动车尾气的混合污染[25].另一方面,太原市地理与气象特征导致污染物输送和稀释能力较弱,污染物容易积聚[26].与太原PM2.5污染特征相区别的是,长三角和珠三角出现以高浓度臭氧为典型特征的光化学污染问题[27].在光化学污染过程中,多花芳烃等有机污染物可能转化为生物毒性更强的痕量有机物[28].因此,广州市和杭州市PM2.5处理组小鼠虽未表现出纤维化的特征,但也发生了较为明显的肝脏病变,这种差异性的毒性终点可能与特定区域内大气二次转化生成的一些有机物种相关.本研究结果发现,肝脏纤维化与18种多环芳烃中的绝大多数与存在明显相关性,而贡献这一效应的金属组分数量则相对较少.综上所述,太原市PM2.5暴露诱导了小鼠肝脏纤维化的发生,部分金属组分和绝大多数多环芳烃可能是诱导肝脏纤维化的关键毒性组分.

利用实验动物模型甄别PM2.5诱发肝脏纤维化的关键毒性组分行之有效我们前期的数据表明[20],太原、北京、杭州和广州组PM2.5流体力学尺寸分别为790.3±30.3、936.8±34.01、1364±46.51和938.2 ±51.75nm.此外,整个采样期间四个城市的 PM2.5浓度均值显示,太原、北京、杭州和广州组PM2.5浓度分别为101.2、40.7、77.5和80.9 μg/m3.诚然,PM2.5的健康效应与其浓度、粒径和化学组成密切相关.但目前对特定污染区域PM2.5的原位实时暴露尚处于起步阶段,将PM2.5暴露于实验动物的试验方法用于反映实际人体实际环境暴露情况尚有局限.因此,本研究按照暴露-效应-关键组分识别的研究思路,在保证不同城市PM2.5剂量相同、粒径相近的条件下采用咽后壁滴注的方式进行小鼠PM2.5暴露试验,以期对PM2.5中可能导致肝脏纤维化的关键组分进行初步筛选,后续将以本研究初筛出的关键组分单独或与诱导肝脏纤维化效应不明显的城市PM2.5复合暴露于小鼠,再检测肝脏纤维化的病理结构及标志物,进一步验证PM2.5关键毒性组分的作用,阐明PM2.5致小鼠肝脏纤维化的区域毒性差异.总之,本研究为不同典型污染过程中细颗粒物主控效应成分的筛选与识别提供了较好的方法学与前期数据,有助于阐明地区间PM2.5诱导肝脏纤维化差异的根本原因.

4 结论

4.1 PM2.5暴露能够诱导小鼠肝脏纤维化的发生,且存在区域差异性,太原市PM2.5诱导肝脏纤维化发生最为显著,TGF-β及其通路中相关信号分子MMP2在介导PM2.5诱发肝脏纤维化发生中发挥了重要作用.

4.2 Cr、Mn、Mo、Cs、Pb、Bi、U和Fe等金属组分与多环芳烃(PAHs)可能是PM2.5中诱导肝脏纤维化的一些关键成分.

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Differential Effects of PM2.5from different cities in the induction of hepaticfibrosis in mice.

YAN Zhi-peng, LI Shu-yue, XING Qi-song, NAN Nan, QIN Guo-hua*, SANG Nan

(College of Environmental and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)., 2022,42(6)：2878～2885

To clarify the potential mechanism by which PM2.5exposure causes liver fibrosis and the key components leading to this adverse effect, 10-month-old C57BL/6 female mice were exposed to PM2.5from different cities of China (Taiyuan, Beijing, Hangzhou and Guangzhou) for 4weeks. And tissue section staining, qRT-PCR and Western-blot technique were used to evaluate the features of liver fibrosis in mice. Pearson correlation coefficient was used to analyse the correlation between the expression level of liver fibrosis-related genes in mice and the typical chemical composition of PM2.5from different cities. The results showed that a significant decrease in the organ coefficient of liver was found in Taiyuan and Hangzhou PM2.5-exposed group. Taiyuan PM2.5exposure significantly increased the area of collagen deposition and the relative expression level of fibrosis related genes (,,and) in the mice liver, and only PM2.5from Taiyuan induced the significant increase ofprotein in mice liver, while PM2.5from other cities except Taiyuan exposure did not cause any of the above changes in fibrosis related factors. In addition, the results of correlation analysis showed that the metal components such as Cr, Mn, Mo, Cs, Pb, Bi, U and Fe were positively correlated with the mRNA expression ofand. Except for NA, AC and BaP, the other 15PAHs were significantly correlated withmRNA expression, and the sum of 18EPA PAHs was significantly correlated with. The above results indicated that PM2.5exposure induced hepatic fibrosis in mice, especially PM2.5from Taiyuan. TGF-β and related signal molecules in its pathway has beenshownto play a vital role in mediating liver fibrosis induced by PM2.5. Cr, Mn, Mo, Cs, Pb, Bi, U, Fe and PAHs of PM2.5were probably critical components to induce liver fibrosis.

PM2.5；liver；fibrosis；critical component

X171.5

A

1000-6923(2022)06-2878-08

闫志鹏(1996-),男,山西晋中人,山西大学博士研究生,主要研究方向为环境毒理与健康.

2021-11-03

国家自然科学基金资助项目(22076109,21777091);职业安全健康北京市重点实验室开放课题(2021)

* 责任作者, 教授, qinguojua@sxu.edu.cn