57例脊柱感染手术患者NGS检测分析

刘春，朱超，臧雨峰，黄必军，何博，张振，张玉发，钱明

(1.青岛大学附属上海德济医院骨科，上海 200331；2.青岛大学附属上海德济医院检验科，上海 200331；3.海军军医大学附属长征医院骨科，上海 200003)

脊柱感染发病率为0.004‰～0.01‰，其死亡率为2%～4%，其中以胸腰椎感染多见[1-2]。主要原因是病原体在脊柱部位的定植，其病原体包括细菌、真菌、病毒及结核分支杆菌等。脊柱感染包括脊椎骨髓炎、椎间盘炎和硬膜外脓肿等，常由远处病灶血行播散至1个或多个椎体引起，其他感染原因还包括临床有创操作，如穿刺操作、针灸、手术等，也可见于邻近组织播散等[2-5]。脊柱感染的诊断主要根据临床症状、体征、实验室检查、影像学检查等，常规微生物培养作为感染诊断的直接证据是诊断感染的金标准[2，6-7]，但其存在需要足够细菌载量、培养周期较长以及假阴性率高等诸多不足，不利于感染疾病的快速精确诊断。目前随着基因检测技术的进步，宏基因二代测序(next-generation sequencing technology，NGS)技术在脑脊液、血液、假体周围感染等标本中的诸多检测优势已逐步展现[8-11]，目前感染科、呼吸科已广泛用于血液、体液标本的检测。金文婷等[5]2020年曾报道通过CT引导穿刺抽取感染病灶送检NGS及常规微生物培养，NGS在病原检测阳性率、检测周期方面均表现出明显优势，能够快速的检测出致病原，指导临床早期精确治疗。但目前关于脊柱感染的NGS检测相关研究较少，本研究通过手术取出脊柱感染病灶组织，同时行NGS及培养基培养检测，对两者检测阳性率、检测周期进行回顾性对比分析，探讨NGS在脊柱感染诊治中临床价值，研究结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年6月至2020年12月年在青岛大学附属上海德济医院行开放手术治疗的脊柱感染患者的临床资料进行回顾性对比分析研究，本次统计病例共计80例，去除后期病理检测证实为肿瘤9例，未送检NGS检测14例，共57例纳入研究。57例中男性41例，女性16例；年龄21～76岁，平均年龄为(55.32±12.56)岁。感染部位：颈椎10例，胸椎20例，腰椎27例。脊柱感染诊断参考2019年欧洲核医学协会、欧洲骨与关节感染学会和欧洲放射学会联合发布的外周骨感染诊断指南[12]，包括：(1)可能存在部分神经功能障碍；(2)实验室检查：C-反应蛋白及血沉偏高，血白细胞、降钙素原可正常；(3)可有发热病史，伴有病变部位疼痛；(4)影像学检查提示脊柱骨质侵犯，骨髓水肿、侵蚀[12-13]。手术指征包括：(1)神经症状进行性加重，病程>3个月；(2)疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS)≥5分；(3)胸腰椎日本骨科协会(Japanese orthopaedic association，JOA)评分≤15分。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)综合术前影像学检查及实验室检查、病史等资料，初步诊断脊柱感染；(3)有疼痛、麻木感等神经症状。排除标准：(1)术后病理证实为肿瘤；(2)未送检NGS或培养基培养。本研究经医院伦理委员会审查通过。

1.3 脊柱病灶组织取样方法 57例均行后路开放手术，取出病灶组织同时送检NGS及常规微生物培养。

1.4 检测方法

1.4.1 常规微生物培养 标本接种于分区划线的血平板和巧克力平板，血平板、巧克力平板放CO2培养箱。35 ℃培养18～24 h。病灶组织标本成组织匀浆，分别接种于血琼脂平板细菌培养，接种于念珠菌显色平板行真菌培养，分枝杆菌培养系统(MGIT960)进行分枝杆菌培养。

1.4.2 NGS检测 样本处理和DNA提取：按照标准样本采集流程采集标本，进行物理破壁、酶破壁，混合震荡后取300μL样本按照TIANamp Micro DNA Kit试剂盒步骤提取DNA。文库构建和测序：对提取好的核酸进行酶切片段化、末端修复、接头连接及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)进行文库构建，使用Agilent 2100 Bioanalyzer质控文库片段大小为300 bp左右，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit质控DNA文库浓度，检测后的浓度按照等质量进行混合测序，混合后的文库经环化形成单链。再经复制加载到测序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000进行测序。数据分析：通过bwa序列比对将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除。剩下的数据在去除低复杂度reads后与华大pmdb病原数据库进行比对，获得能够匹配到某种病原体的序列数，根据序列数的高低以及临床其他检测来判断可能的病原体。

2 结 果

2.1 检测细菌分析 通过NGS检测出细菌病例数达到28例，通过常规微生物培养检测出细菌病例数为9例，两者对比差异有统计学意义(F=13.579，P<0.001)，NGS检测方法具有显著性优势(见表1)。

表1 NGS与常规微生物培养检出结果(例)

57例中NGS检测阳性共计38例，阳性率66.7%，阳性结果中细菌感染共28例，占73.7%。NGS检测出序列数最高的主要致病细菌以葡萄球菌、链球菌、肠球菌为主，其中6例存在3种以上细菌混合感染，7例存在2种细菌混合感染，15例为1种细菌感染，另外细菌感染合并其他微生物如结核、真菌感染多达15例。培养基培养检测阳性10例，阳性率26.3%，细菌9例、真菌1例(见表2，见图1)。

表2 主要致病细菌结果分布(例)

图1 NGS检测细菌种类详细分布图

2.2 真菌、病毒、结核分枝杆菌结果分析 NGS检测结果，真菌感染阳性8例(14.0%)，病毒检测阳性12例(21.1%)，结核分支杆菌阳性12例(21.1%)。常规微生物培养仅有真菌1例阳性。

2.3 检测周期结果分析 常规微生物培养检测周期3～7 d，平均时间(5.0±2.1)d；NGS检测周期24～36 h，平均时间(30.4±6.2)h。NGS检测相比常规微生物培养检测所需周期更短。

3 讨 论

脊柱感染发病率较低，感染科、骨科及影像科医生很难将其与非感染性疾病相区分。以往的检测技术(如常规微生物培养)很难明确致病原，脊柱感染确诊多数依赖于临床、实验室及影像学资料，血液培养阳性率较低，病灶组织无法获取送检标本，且培养基培养阳性率仅35%左右[5]。培养周期相对较长，临床治疗多依赖于经验性抗感染，缺乏针对性。对于难以诊断的脊柱感染病例，诊断学穿刺是确诊及鉴别诊断的最佳方案。既往研究报道经CT引导下穿刺的阳性率为47%～100%。若穿刺前已进行抗感染治疗，活检微生物结果极大可能出现假阴性。金文婷等[5]曾研究CT引导穿刺取出病灶组织送检NGS指导临床治疗，NGS作为新一代检测手段，在脊柱感染早期快速诊断、开展精准治疗方面具有更大的优势，通过人类基因库数据比对，NGS检测在脓毒血症[14]、假体周围感染[15]、中枢感染[16]中已展示出快速、准确的优势。本研究中，对于符合手术指征的病例，采用开放手术取出病灶组织行NGS检测，发现NGS检测有利于快速明确脊柱感染的致病原，为临床早期精准治疗提供关键的病原学依据。

作者观察的38例检测阳性病例中微生物分布以细菌为主，占阳性结果的73.7%，与以往临床研究结果一致[17]。NGS检测周期一般为24～36 h，相比常规微生物培养周期(需要72 h以上)，检测周期明显减少，为临床早期、快速治疗创造了条件。在厌氧菌感染中，李冰等[14]曾报道NGS检测阳性率达到82.76%；而在假体周围感染病例中，郝林杰等[8]曾报道NGS检测阳性率也达到88.2%。金文婷[5]曾报道NGS检测在脊柱感染病例中阳性率达到62.5%，与本研究的66.7%阳性率基本相一致。

本研究中，结核分枝杆菌NGS检测阳性12例，阳性率达到21%，检测周期平均(24±8)h，与文献报道肺外结核发病率10%以上相符合[18]。然而12例结核菌感染病例常规微生物培养无阳性病例，因此NGS在检测结核菌感染中具有明显的优势。

在常规微生物培养阳性率较低的真菌中，NGS检测阳性率也达到14%，与文献报道真菌感染阳性率11.3%一致，脊柱感染以念珠菌及曲霉菌最为常见[19]。甚至在无法培养的病毒感染病例中，NGS检测阳性率达到了21.1%。杨新明卜等[20]曾报道布氏杆菌脊柱感染病例中，手术取标本送检脓液培养阳性结果率仅50%。本研究中有1例初步诊断感染病例中，曾使用万古霉素、美罗培南等多种高级抗生素治疗，体温无法控制，炎症指标持续上升，通过NGS检测，术后24 h即快速明确诊断为布氏杆菌感染，术后针对病原菌抗感染治疗后症状得以控制，患者临床疗效较好。

综上所述，对比常规微生物培养，NGS检测在细菌感染病例中检测阳性率更高同时周期更短，特别是在真菌、病毒感染病例中具有显著性优势，且在部分非特异性感染病例中，诸如布氏杆菌、结核分支杆菌等培养基培养无法明确的微生物具有绝对的优势[21-22]。因此，NGS检测技术在脊柱感染手术治疗病例中发挥了重要的作用，值得大力推广。本文病例基数少，缺乏大样本数据分析，且随访周期相对较短，还需要更长时间随访、更高质量的随机对照研究评估NGS在脊柱感染中的临床应用价值。