根皮素抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞氧化应激反应

李琛琛 徐君美 贺芊芊 李嘉嬴 李志恒 徐志卿 杨予涛

(首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京 100069)

抑郁症是一种高发病率的情感类精神疾病，且具有很强的致残性和复发性[1-2]，如果不予以及时干预可严重影响患者的生活质量，甚至导致其自杀、自伤行为的产生[3-4]。

研究[5-6]显示，小胶质细胞在应激状态下的过度激活可释放大量活性氧等氧化应激产物，可引起神经元的凋亡或坏死[7-8]。相关临床和动物研究[9-10]显示，脑内小胶质细胞的过度激活及相关氧化应激产物的水平与焦虑、抑郁样行为的发生密切相关，而予以抗氧化应激治疗则可在一定程度上改善其抑郁症状[11-12]。

核因子-E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化响应元件(antioxidant reaction element，ARE)信号通路是调节小胶质细胞激活并抑制其产生氧化应激产物的重要信号通路。当发生氧化应激时即可引起Nrf2发生磷酸化，磷酸化的Nrf2向细胞核内迁移与并和抗氧化基因启动子的ARE顺式作用元件结合，增高抗氧化基因的表达，抑制氧化应激反应，进而避免细胞的损伤凋亡[13-15]。已有研究[16-18]表明激活Nrf2/ARE信号通路，可明显抑制抑郁动物情绪相关脑区氧化应激产物释放，减少神经元的损伤和凋亡而发挥抗抑郁的作用。

目前抑郁症在临床上以主要通过选择性5-羟色胺再摄取抑制剂类药物(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)进行治疗。研究[19-21]表明当前使用的抗抑郁药物虽然能改善部分患者的抑郁症状，但仍有较多的不良反应和禁忌证。因此，探索低不良反应、高经济性和安全性的化合物对抑郁的治疗具有重要的意义。

根皮素(phloretin, PHL)是一种来源于多汁水果果皮和根皮中的黄酮类化合物。目前，PHL已被美国食用香料与提取物制造者协会(Flavor and Extract Manufactures Association of the Unite States，FEMA)列为公认安全物质(generally recognized as safe，GRAS)。PHL易于提取，经济成本较低[22]。已有研究[23]表明PHL能够通过抗氧化应激发挥肝保护作用，但是PHL能否抑制小胶质细胞激活后的氧化应激反应及相关的分子机制仍待进一步阐明。因此，本研究通过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的氧化应激损伤的细胞模型，探讨PHL是否通过影响Nrf2/ARE信号通路从而抑制BV2小胶质细胞的过度氧化应激，相关研究为PHL的神经保护作用提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PHL(北京洪湖联合化工公司)；LPS(美国Sigma公司)；MTS检测试剂盒(美国Promega公司)；一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)；NO、MDA、SOD、GSH检测试剂盒(中国索莱宝公司)；脂质体3000转染试剂(美国Invitrogen公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega公司)；磷酸化Nrf2抗体(中国Bioss公司)；HO-1抗体、β-actin抗体(中国Proteintech公司)；IRDye 680RD 和RDye 800CW荧光二抗(中国Life公司)；抗氧化响应元件荧光素酶报告基因质粒(中国吉满生物科技公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 BV2小胶质细胞培养

BV2小胶质细胞为本实验室冻存，复苏后使用F12/DMEM培养基加入10%(体积分数)胎牛血清在37 ℃，5%(体积分数)CO2培养箱中进行培养，隔天换液，每隔2 d传代，显微镜下观察细胞的形态，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 实验分组

待BV2小胶质细胞进入对数生长期后，将其分为6个组分别为：①对照组(Control);②LPS处理组(LPS);③LPS+1 μmol/L PHL预保护组[PHL(1 μmol/L)+LPS];④LPS+10 μmol/L PHL预保护组[PHL(10 μmol/L)+LPS];⑤LPS+20 μmol/L PHL预保护组[PHL(20 μmol/L)+LPS];⑥20 μmol/L PHL处理组[PHL(20 μmol/L)]，对照组不作处理，模型组给予LPS(100 ng/mL)24 h，PHL预保护组给予低、中、高浓度PHL 12 h后，给予LPS 24 h，PHL(20 μmol/L)组给予PHL 36 h。Nrf2磷酸化是Nrf2发生核转移，发挥抗氧化作用的关键步骤。将BV2小胶质细胞分为如下4个组：对照组、LPS处理组、LPS+10 μmol/L PHL组，LPS+20 μmol/L PHL组。本研究选择具有明显保护效果的根皮素预处理浓度进行后续的双荧光素酶活性检测和Western blotting实验。

1.2.3 MTS 细胞活性检测

上述6组细胞各处理结束后，弃去旧培养基，每孔加入100 μL 含20 μL 96孔细胞增生检测试剂完全培养基，在37 ℃，5%(体积分数)CO2的环境下孵育2 h后，酶标仪于490 nm读取吸光值。

1.2.4 BV2小胶质细胞中NO、MDA、GSH和SOD活性检测

上述各组细胞处理结束后，收集细胞培养上清，收集各组细胞，按照试剂盒的操作说明按步骤加入试剂盒中所提供的试剂，结果根据标准溶液的浓度与吸光度绘制的标准曲线或说明书中提供的计算公式含量测定各组NO、MDA、GSH含量以及SOD活性。

1.2.5 双荧光素酶活性检测

各组细胞处理结束后每孔加入100 μL细胞裂解液于摇床上裂解20 min，取30 μL细胞裂解液加入30 μL 荧光素酶检测试剂，使用光度检测仪测定读数记为荧光值1，再加入30 μL反应终止液测定读数记为荧光值2，以荧光值1/荧光值2的比值作为相对荧光素酶活性。

1.2.6 Western blotting法检测

各处理组细胞加入100 μL裂解液，裂解，离心，收集上清，检测蛋白浓度。使用10%(质量分数)PAGE胶进行电泳，再以300 mA，90 min进行湿转，湿转后将PVDF膜用10%(质量分数)脱脂奶粉封闭1 h，TBST缓冲液洗膜5 min×3次。4 ℃条件下，一抗(1∶1 000)孵育过夜，TBST缓冲液洗膜5 min×3次后，加入二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h后，扫膜。使用图像处理软件Image J对蛋白条带的灰度值读数，以β-actin作为内参，与内参灰度值读数相比，计算各处理组比值占正常对照组比值的倍数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PHL预处理可改善LPS导致的BV2小胶质细胞活力降低

与对照组相比，LPS处理组其BV2小胶质细胞活力比值为0.70±0.05，明显降低(P<0.001)。PHL(1 μmol/L)+LPS组为0.80±0.06；PHL(10 μmol/L)+LPS组为0.85±0.04；PHL(20 μmol/L)+LPS组为0.94±0.06，PHL可在一定程度改善LPS导致的BV2小胶质细胞活力下降(P<0.01)；随着PHL浓度升高，BV2小胶质细胞活力也随之增加，PHL的保护作用具有一定的浓度依赖性。此外，PHL(20 μmol/L)组为0.95±0.04，与对照组相比, 单独予以20 μmol/L PHL处理并未引起BV2小胶质细胞活力出现明显改变，差异无统计学意义(P>0.05，n=5，图1)。

图1 PHL预处理可改善LPS导致的BV2小胶质细胞活力降低

2.2 PHL预处理可降低LPS导致的BV2小胶质细胞NO、MDA浓度升高

正常对照组细胞上清中NO浓度为(3.30±0.72)μmol/L，细胞内MDA浓度为(0.42±0.03)nmol/mg，LPS处理组NO浓度为(8.15±0.39)μmol/L，MDA浓度为(0.95±0.07)nmol/mg，与对照组相比，NO、MDA浓度显著增加(P<0.001)。PHL(1 μmol/L)+LPS组NO浓度为(3.42±0.33)μmol/L, MDA浓度为(0.54±0.08)nmol/mg；PHL(10 μmol/L)+LPS组NO浓度为(2.73±0.39)μmol/L，MDA浓度为(0.47±0.05)nmol/mg；PHL(20 μmol/L)+LPS组NO浓度为(2.60±0.81)μmol/L，MDA浓度为(0.46±0.05)nmol/mg，与LPS处理组相比，PHL可在一定程度抑制LPS导致的BV2小胶质细胞上清中NO的浓度、细胞内MDA浓度升高(P<0.01)且PHL的抑制作用存在一定的浓度依赖性。此外，PHL(20 μmol/L)组上清中NO浓度为(2.57±0.44)μmol/L，MDA浓度为(0.42±0.02)nmol/mg，与对照组相比，单独予以20 μmol/L PHL处理，并未引起细胞上清中NO浓度、细胞内MDA浓度出现明显改变，差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

图2 PHL预保护可降低LPS导致的BV2小胶质细胞NO及MDA水平升高

2.3 PHL预处理可改善LPS导致的BV2小胶质细胞内GSH及SOD活性浓度降低

正常对照组细胞GSH浓度为(23.66±1.32)μg/mg，SOD活性为(18.03±1.52)U/mg，LPS处理组GSH浓度为(18.01±0.49)μg/mg，SOD活性为(9.33±0.37)U/mg，与对照组相比，LPS处理组GSH、SOD活性浓度明显降低(P<0.001)。PHL(1 μmol/L)+LPS组GSH浓度为(21.76±0.40)g/mg，SOD活性为(12.41±0.63)U/mg；PHL(10 μmol/L)+LPS组细胞GSH浓度为(22.48±0.40)μg/mg，SOD活性为(14.74±1.07)U/mg；PHL(20 μmol/L)+LPS组细胞GSH浓度为(22.75±0.50)μg/mg，SOD活性为(18.70±1.17)U/mg；与LPS处理组相比，PHL可在一定程度改善LPS导致的BV2小胶质细胞内GSH、SOD活性浓度降低(P<0.01)，随着PHL浓度升高，PHL的改善作用存在一定的浓度依赖性。此外，单独予以20 μmol/L PHL处理，细胞内GSH浓度为(21.92±1.50)μg/mg，SOD活性为(20.44±0.62)U/mg，与对照组相比，BV2小胶质细胞内GSH、SOD活性浓度未出现明显改变(P>0.05，图3)。

图3 PHL预处理可改善LPS导致的BV2小胶质细胞内GSH及SOD活性浓度降低

2.4 PHL预处理可上调BV2小胶质细胞Nrf2蛋白的磷酸化水平

与对照组比较，LPS处理组其Nrf2磷酸化水平相比于对照组为1.95±0.59，略有增加(P<0.05)。与LPS处理组比较，给予不同浓度PHL预保护12 h后，PHL(10 μmol/L)+LPS组为3.60±0.85，PHL(20 μmol/L)+LPS组为3.89±1.01，PHL可进一步上调Nrf2的磷酸化水平(P<0.05, 图4)。

图4 PHL预处理可上调BV2小胶质细胞Nrf2蛋白的磷酸化水平

2.5 PHL预处理可上调BV2小胶质细胞ARE-LUC报告基因的转录活性

双荧光素酶报告基因检测结果显示，正常对照组BV2小胶质细胞相对荧光素酶活性为31.24±8.20，LPS处理组为54.19±5.31，相对荧光素酶活性略有上升(P<0.05)。与LPS处理组相比，PHL(10 μmol/L)+LPS组为89.44±6.12，PHL(20 μmol/L)+LPS组为107.20±19.42，PHL可在一定程度上进一步上调相对荧光素酶活性，且上调作用存在一定的浓度依赖性(P<0.05，图5)。

图5 PHL预处理可上调BV2小胶质细胞ARE-LUC报告基因转录活性

2.6 PHL预处理可上调BV2小胶质细胞HO-1 蛋白水平

采用Western blotting法检测了各组细胞内HO-1蛋白表达水平。LPS处理组HO-1蛋白表达水平相比于对照组比值为1.80±0.32，LPS处理组HO-1蛋白表达水平增加(P<0.05)。PHL(10 μmol/L)+LPS组比值为2.13±0.24，PHL(20 μmol/L)+LPS组比值为2.24±0.32，与LPS处理组相比，给与不同浓度PHL预保护12 h后可进一步上调HO-1蛋白表达水平(P<0.05，图6)。

图6 PHL预处理可上调BV2小胶质细胞HO-1 蛋白水平

3 讨论

本研究首先建立了LPS诱导的BV2小胶质细胞氧化应激损伤模型。与既往报道[24]一致。相关实验结果证明，LPS是导致BV2小胶质细胞过度激活后产生大量氧化应激产物的重要介质，该细胞的氧化应激模型适宜相关研究的展开。

本研究发现给与BV2小胶质细胞氧化应激损伤模型12 h的PHL预处理，可以明显降低LPS导致的BV2小胶质细胞氧化应激产物的释放，且PHL的保护作用还存在一定的浓度依赖性。在中枢神经系统中，Zhang等[25]研究结果显示，PHL同样能够抑制神经系统炎性反应从而改善MPTP诱导小鼠产生的帕金森障碍。此外，还有研究[26]报道PHL能够改善高糖介导H9c2细胞的氧化应激与炎性反应损伤。上述研究结果表明在细胞水平上PHL确实具有一定的抗炎抗氧化作用，具有治疗抑郁症的潜在应用价值。

为了阐明PHL对LPS导致BV2小胶质细胞氧化应激损伤的保护作用的分子机制，本研究探讨了PHL对Nrf2/ARE信号通路的影响。LPS处理BV2小胶质细胞后，Nrf2蛋白磷酸化水平、HO-1蛋白的表达也有一定程度的增高，结果与既往研究[27-28]结果一致，推测上述现象可能是BV2小胶质细胞对LPS处理的一种防御性代偿反应。当BV2小胶质细胞用PHL预处理后，可进一步得升高Nrf2蛋白磷酸化水平，上调ARE转录活性，增加HO-1蛋白表达，且PHL的上述作用还存在一定程度的浓度依赖性。以往研究[29]表明当细胞发生氧化应激时，稳定状态下的 Nrf2 发生磷酸化，解除与Keap1结合而由胞质向胞核转移，进入细胞核后识别并与ARE结合，启动ARE调控的多种抗氧化应激蛋白的基因转录发挥抗氧化应激的作用。在本研究中，利用Western blotting 以及双荧光素活性检测证明PHL能够增高Nrf2磷酸化水平，上调ARE转录活性，增加HO-1蛋白的表达，暗示Nrf2/ARE通路可能是根皮素在发挥抗氧化应激的作用中的途径之一。