AM 真菌群落结构对4 种不同科属植物根系特征的响应

刘雅洁，王玉丹，曹红月，王琦玲，李海薇，阚佳莹，杨春雪

（东北林业大学园林学院, 黑龙江 哈尔滨 150040）

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae, AM)真菌是活体专性共生菌，在各种土壤生境中均广泛存在，人工绿地以及盐碱地等特殊生境中也被报道有AM 真菌分布[1-3]。AM 真菌能与大部分的维管植物共生[4]，并在提高植物抗逆性、修复污染环境、保持生态系统稳定和持续生产等方面发挥重要的作用[5]。然而AM 真菌的分布及其在土壤中的多样性受到诸多因素的影响，如土壤受侵蚀程度、环境中的病虫害和地表的植被种类等[6]。植物群落作为AM 真菌的共生群体，其群落组成可直接影响AM 真菌的多样性。不同植物占据优势的群落，其根围土壤内的AM 真菌多样性存在差异[7]。一般认为，AM 真菌的出现会对植物的显微结构和根系结构特征产生影响[8-9]，此外，植物根系在皮层和细胞间隙等显微结构方面的差异也影响AM 真菌的侵染，进而影响根围AM 真菌的多样性及其分布[10]，然而，植物的根系结构特征是否也会影响AM 真菌的分布及其多样性，目前尚且缺乏研究。

二月兰(Orychophragmus violaceus)、 狼尾草(Pennisetum alopecuroides)、 肥 皂 草 (Saponaria officinals)、八宝景天(Sedum spectabile)是东北地区常用的绿化材料，且4 种植物在各地绿化中均有应用，分布范围广，具有较高的代表性，其观赏效果良好且管理粗放[11-13]，可以维持春、夏、秋三季景观。4 种植物材料分属于不同科(属)，二月兰为十字花科诸葛菜属，狼尾草为禾本科狼尾草属，八宝景天为景天科八宝属，肥皂草为石竹科肥皂草属，其根系结构特征差异较大，且已有研究表明，4 种植物或同科(属)植物可以作为AM 真菌的宿主植物[14-17]。因此，本研究选择同一生长环境下的二月兰、八宝景天、肥皂草和狼尾草作为研究对象，运用传统的形态学鉴定方法，研究4 种植物根围的AM 真菌多样性，并测定其根系结构特征，旨在确定同一生境下不同植物根围AM 真菌群落的差异，并阐明植物根系结构特征对其根围AM 真菌群落的影响。

1 材料与方法

1.1 样地概况

采样地位于黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校园的新校区、老校区以及家属区(126°33′28″ E，45°44′26″ N)，校园的主要绿化材料为二月兰、八宝景天、狼尾草和肥皂草等，植被覆盖率较高，植物养护管理状况佳。气候类型为温带大陆性季风气候，春秋短，气温升降变化快。

1.2 采样方法

2017 年10 月20 日，按照“多点混合法”与“平行采样对照法”，于生长有4 种植物的3 个地块(新校区、老校区和家属区，记为A、B、C 样地)随机选取试验材料，4 种植物每地各取5 株，共计60 株。除去每株植物根围10 cm 表层的石块及枯叶杂质，每株按东南西北4 个方向，用小铲轻轻挖取距地表10 − 20 cm 深的根围土壤并采集完整植株，首次4 个方向共获取根际土壤1.5 kg，随后混合并采用“四分法”保留 1 kg，将剩余的土壤放入袋中，编号后带回，在室内风干过0.85 mm 筛后保存于4 ℃冰箱，以备后续AM 真菌孢子分离鉴定及土质测定用。采集的植株去除地上部分后，水中浸泡，使根系与土壤分离并洗净，4 种植物的根系分别装袋并保存。

1.3 AM 真菌孢子的分离、鉴定

采用湿筛倾析-蔗糖离心法[18]筛取4 种植物100 g 根际土壤中的AM 真菌孢子，将筛出的孢子收集到培养皿中，在双管实体解剖镜下统计孢子数量并初步观察孢子特征。之后用移液枪将单个孢子吸出到载玻片上，加乳酸制片后在光学显微镜(型号OLYMPUS-DSX500)下观察孢子的颜色、孢壁特征、连孢菌丝、孢子大小等并拍照记录。随后用Melzer’s 试剂对孢子进行染色，拍照记录其特异性变化。最后根据《VA 菌根真菌鉴定手册》[19]及国际丛枝菌根真菌保藏中心(INVAM)网站上的菌种描述和图片以及近几年新发布的菌种资料对AM 真菌种属进行鉴定[20-22]。

1.4 AM 真菌多样性指标计算

物种丰度(species richness, SR)：指植物根际100 g土壤中含有的AM 真菌种的数目。

相对多度(relative abundance, RA)：指种的个体数在群落总物种数中的比例。

RA= 该采样点某种的孢子数/该采样点孢子总数 × 100%。

1.5 土壤理化性质测定

每样地4 种植物根围采集的土样各称取10 g，充分混合后，测定采样地的土质状况。土壤酸碱度以土水比1 ： 5 浸提液的pH 表示，使用PHS-3C 型pH 计(上海雷磁科学仪器厂)测定；土壤含盐量以土水比1 ： 4 饱和浸提液的电导率表示，使用DDS-11A 型电导率仪(上海精密仪器厂)测定；采用重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量[23]，所有指标重复测定3 次。

1.6 根系结构特征确定

根系洗净后吸干水分，利用根系扫描仪(LA2400 Scanner)获得完整的根系扫描图像，并使用Win-Rhizo 根系分析系统(Regent Instruments Inc., Canada)分析根系扫描图像，获得根长、表面积、投影面积、平均直径、总体积、根尖数、分枝数和交叉数共8 项结构特征的数据。

1.7 数据分析

采用Photoshop CC 2019 处理图像，Word 2016 和Excel 2016 进行数据计算。采用SPSS 25 对数据进行单因素方差分析(ANOVA)和根系结构特征主成分提取，使用R4.1.1 Vegan 包Vegdist 函数检验不同植物根围AM 真菌群落组成相异度，Diversity 函数计算AM 真菌群落的Shannon-Wiener 指数和Simpson指数，Decorana 函数计算AM 真菌群落数据的Axis length， genescloud (https://www.genescloud.cn)用于Venn 图和CCA 典范对应分析构建。Shannon-Wiener指数(H)和Simpson 指数(D)计算公式如下：

式中：S为总物种数，Pi表示种i的相对多度。

2 结果与分析

2.1 取样地的土壤理化特性

单因素方差分析表明(表1)，3 个地块之间的pH 差异不显著(P＞ 0.05)，电导率存在显著差异(P＜0.05)，说明4 种植物均具有一定的环境适应性。新老校区之间有机质含量无明显差异(P＞ 0.05)，且三地平均值为5.58%，三地均属高肥力土壤(＞ 4%)。

表1 东北林业大学的土壤理化特性Table 1 Soil physicochemical properties of Northeast Forestry University

2.2 4 种植物根围AM 真菌种类

从二月兰的根围土中分离得到AM 真菌4 属7 种，包括内养囊霉属(Entrophospora)和原囊霉属(Archaeospora)各1 种，无梗囊霉属(Acaulospora)2 种，球囊霉属(Glomus) 3 种；狼尾草的根围土壤中鉴定到5 属15 种，其中球囊霉属9 种，无梗囊霉属1 种，盾巨孢囊霉属(Scutellospora)和内养囊霉属各2 种，原囊霉属1 种；肥皂草根围土壤中经鉴定共得到AM 真菌3 属7 种，以球囊霉属最多，为4 种，盾巨孢囊霉2 种，内养囊霉属1 种；八宝景天根围土壤中分离出AM 真菌孢子5 属7 种，无梗囊霉属、盾巨孢囊霉属、巨孢囊霉属(Gigaspora)和内养囊霉属各1 种，球囊霉属3 种。从4 种植物的根围共鉴定出AM 真菌27 种，各菌种的形态及特征描述如表2、图1 所示。

图1 4 种植物根围AM 真菌孢子特征Figure 1 Sporal characteristics of AM fungi in the rhizosphere of four plants

表2 4 种植物根围AM 真菌种类及特征Table 2 Species and characteristics of AM fungi in the rhizosphere of four plants

续表2(1)Table 2(Continued)

续表2 (2)Table 2 (Continued)

2.3 4 种植物根围AM 真菌的多样性指标

4 种植物根围占比最大的AM 真菌属均为球囊霉属，其在4 种植物根围的总占比为58.73%，二月兰、狼尾草、肥皂草和八宝景天根围的球囊霉属AM 真菌相对多度分别为50.07%、75.07%、77%和32.78%。4 种植物根围的AM 真菌具有一定的多样性，4 种植物的Shannon-Wiener 指数分别为1.785、2.547、1.634 和1.859，Simpson 指数分别为0.816、0.91、0.734 和0.83；4 种植物根围的优势AM 真菌种分别为幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、黑球囊霉(G. melanosporum)、网状球囊霉(G. reticulatum)和丽孢无梗囊霉(Acaulospora elegans)；稀有菌种分别为黄金球囊霉 (G. aureum)、 网纹盾巨孢囊霉(Scutellospora reticulata)、 异配盾巨孢囊霉 (S.heterogama)和长孢球囊霉(G. dolichosporum)。4 种植物根围AM 真菌组成的聚类结果(图2)表明，沙荒球囊霉(G. deserticola)和细凹无梗囊霉(A.scrobiculata)的发生具有一定的相似性而聚为一簇，此外，其他菌种的分布也具有一定的关系，形成了距离不同的聚类结果。同一菌种在不同植物根围的分布及其相对多度都存在较大的差异，群落组成相异度检验表明，植物对AM 真菌的寄生产生影响，限制了AM 真菌的分布(Bray-Curtis ＞ 0.72)。

图2 物种组成聚类Figure 2 Clustering analysis of species composition

对4 种植物根围的AM 真菌群落构建韦恩图(图3)表明，波罗的海内养囊霉(Entrophospora baltica)分布于每种植物的根围土中，其可能对植物的选择性较弱。计算结果显示，二月兰、肥皂草、狼尾草、八宝景天根围所具有的独特AM 真菌种分别占该植物根围AM 真菌分离总数的42.86%、57.14%、66.67%和57.14%，狼尾草所具有的独特菌种最多，这部分AM 真菌的分布可能与植物的根系结构等存在密切关系。

图3 4 种植物根围AM 真菌群落组成的韦恩图Figure 3 Venn map of AM fungal community composition around four plants

2.4 4 种植物的根系结构特征

扫描根系后获得4 种植物的根系图像及特征值(图4、表3)，它们之间在根系形态方面存在差异，狼尾草的根系特征与其他植物存在显著差异(P＜ 0.05)，具有明显的高值，二月兰和肥皂草仅有根尖数指标存在显著差异(P＜ 0.05)，八宝景天根长较短，根尖、分枝和交叉数少，但平均直径明显高于其他植物(P＜ 0.05)。

表3 4 种植物根系结构特征Table 3 Root structure characteristics of four plants

图4 4 种植物根系扫描图像Figure 4 Roots scanning images of four plants

为了得出各项结构特征对植物根系总特征的影响，对根系扫描分析获得的8 项根系结构特征值进行数据降维，共提取到两个主成分，方差百分比累计达到99.684%，它们促使不同植物根系总特征间产生分异。其中PC1 包含根长、根表面积、投影面积、根尖数、分枝数和交叉数，PC2 包含根总体积及平均直径。通过线性组合中的系数计算、模型中的系数计算和归一化，对每个指标的权重进行统计，得出在各个因子中权重最高的根系指标为根表面积(15.83%)和根投影面积(15.83%)，即根表面积和投影面积对4 种植物根系总特征的分异产生了较大的贡献。

2.5 根系结构特征对AM 真菌多样性的影响

经Decorana 函数计算AM 真菌群落数据的Axis length，其得分为5.812 ( ＞ 4)，对根系结构特征值和AM 真菌多样性的关系进行CCA 典范对应分析，并在图中展示丰度值前5 位的AM 真菌种(图5)。结果表明8 项特征均与AM 真菌多样性变化之间存在极显著相关关系(R2＞ 0.9,P= 0.001)，其中根表面积和根投影面积的R2数值最大(R2= 0.999,P= 0.001)，即它们对AM 真菌群落变化的影响力最大。所比对的5 个菌种中，丽孢无梗囊霉和网状球囊霉对不同植物根围AM 真菌多样性分异产生了较大影响；波罗的海内养囊霉影响较小，且丽孢无梗囊霉与根系表面积、投影面积、体积和平均直径之间具有正相关关系。

3 讨论与结论

本次调查共分离出丛枝菌根真菌6 属27 种，4 种植物根围的AM 真菌具有一定的多样性，这表明东北林业大学校园内二月兰、肥皂草、狼尾草和八宝景天根围有丰富的AM 真菌资源，校园绿地中也有AM 真菌分布，这与Halder 等[24-25]的研究结果一致。4 种植物根围占比最大的AM 真菌属均为球囊霉属，这一结果与球囊霉属是广谱共生系统的观点相符合[26]。4 种植物根围的优势菌种不同，此外，八宝景天根围占比最大的属为球囊霉属，而优势种为无梗囊霉属的丽孢无梗囊霉，且丽孢无梗囊霉仅分布在八宝景天根围，分析表明其分布与多项根系特征值相关(图2、图5)，出现这一结果可能是因为丽孢无梗囊霉对八宝景天的根系特征更具有偏好性，球囊霉属的3 个菌种在八宝景天根围相较丽孢无梗囊霉产孢能力较弱，导致丽孢无梗囊霉孢子数量在各菌种中占优势，而球囊霉属孢子的总体数量较多进而表现出较大的占比，这验证了AM 真菌多样性对宿主植物有一定的偏好性的观点[27]。

图5 根系结构特征与AM 真菌多样性的相关性分析Figure 5 Correlation analysis between AM fungal diversity and root characteristics

群落组成相异度和CCA 分析结果表明植物根围AM 真菌的分布与植物种类及其根系结构特征存在显著的相关性，这与以往的研究结论相似[28-29]。本研究中根表面积和根系投影面积与AM 真菌多样性的相关性最强，这可能与根系同土壤的接触面积有关，在人工绿地中，土质相对于重度放牧地带等特殊的生境更佳，降低了植被对AM 真菌的依赖性，孢子密度低[30]，根系表面积和投影面积大的植物增加了自身与土壤的接触，进而成为更多AM 真菌的宿主植物，使土壤中的孢子存活，相应的，根围土中的AM 真菌多样性发生变化，得出二者相关的结论。除此之外，根系长度与AM 真菌多样性也存在一定的相关性，研究表明AM 真菌在0 − 20 cm 的土层孢子密度最高[31]，本研究中所采集的4 种植物，根系长短不一，浅根系类型(如八宝景天)在10 −20 cm 土壤中缺少大量根系为AM 真菌提供寄生环境，或许会导致AM 真菌多样性降低，进而表现出根长与AM 真菌多样性相关。值得注意的是，根尖数、分枝数和交叉数也与AM 真菌多样性存在相关关系；这是因为根系释放的挥发物质会诱导AM 真菌菌丝向根系生长[32]，根尖数、分枝数和交叉数在一定程度上可以表示须根及侧根的数量，而须根及侧根数量较多的植物可能挥发物质释放较多，因此上述3 个指标数值较高的植物更易于形成菌根共生结构，从而影响根围的AM 真菌多样性；另一方面，AM 真菌大多数从植物根毛(成熟区)侵入植物并扩展[33]，大量的根尖、分枝和交叉点可以为AM 真菌的侵染和AM 真菌-植物共生结构的形成提供位点，从而保证土壤中AM 真菌孢子的多样性。典范对应分析结果还表明根系平均直径及总体积与AM 真菌多样性相关，这是因为宿主植物作为菌根的重要碳源，高达20%的光合产物流向菌根系统，同时菌根向根系转运矿物质等保证共生[34]，根系平均直径及总体积与植物地下部的物质交换紧密相关，其数值变化可能影响物质的传输，进而影响植物根围AM 真菌的组成。

4 种植物生长在相同的环境条件下，但根围均存在独特的AM 真菌种。在3 个取样地中，狼尾草和八宝景天往往丛植，肥皂草用于花坛花境或片植，而二月兰多采用林植的形式，4 种植物形成不同的地面覆盖度，地下部的总特征也存在差异，这可能导致了某些特异种的出现[35]。除此之外，可能与AM 真菌侵染过程中对植物根系的识别有关，以往的研究指出，根系分泌的类黄酮和酚类物质可以作为AM 真菌-植物共生的信号物质[36]，且本研究结果表明根系特征与某些AM 真菌种的分布高度相关，根系的结构特征或根系释放的物质被某些AM真菌种所识别从而促进二者形成共生，而这些分泌物和根系特征值或许会对其他某些AM 真菌孢子的萌发产生抑制[37]，从而导致了不同植物根围独特AM 真菌种的出现。

综上，不同植物之间根系结构特征存在的差异影响了AM 真菌群落组成及其多样性，根表面积和投影面积对不同植物产生分异的贡献值最大，且它们与AM 真菌多样性具有强相关关系，此外，研究发现菌种的分布与根系结构特征相关。因此，在AM 真菌资源丰富的特殊地块进行植物选择时，应充分考虑植物的根表面积和投影面积，并考虑特定菌种分布与根系特征之间的关系。