球形棕囊藻对强额孔雀水蚤生长与繁殖的影响*

李 杰，陆家昌，王佳乐，赖俊翔，王英辉*

(1. 广西大学 海洋学院 广西 南宁 530004; 2. 广西科学院 广西近海海洋环境科学重点实验室 广西北部湾海洋研究中心, 广西 南宁 530007)

引 言

近年来，人类的活动加剧了近岸海域的富营养化程度，从而导致了近海赤潮发生的频率逐年增加[1-4]。球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa) 隶属于定鞭藻纲(Haptophyceae/prymnesiophyceae)，定鞭藻目(Prymnesiales)，是一种广温广盐性的的藻类，广泛分布于热带、亚热带以及温带海域[5-7]。自上个世纪90年代末以来，球形棕囊藻赤潮开始在中国近岸海域开始频繁地爆发，而且赤潮持续的时间较长，对渔业，旅游以及海岸带生态环境等造成极大的影响[8-12]，引发的危害不容忽视，与此同时，球形棕囊藻赤潮所关联的生态效应也引起社会各方广泛地关注。

浮游桡足类是海洋浮游植物的重要摄食者, 在海洋初级生产力向高级营养级转化的过程中可以作为转递物质和能量的载体, 是海洋食物网中重要的角色[13-14]。在海洋生态系统中，桡足类的摄食作用可以直接影响到浮游植物的种类、生长、数量和赤潮的发生[15]。桡足类会受到赤潮的影响，赤潮可能会改变其行为方式, 存活以及繁殖能力[16-17]。在海洋食物链中，如果桡足类的丰度因为赤潮受到影响, 那么桡足类的消费者们也有可能受到影响, 因此赤潮对桡足类的影响与近岸海域生态系统的平衡有重要的联系。强额孔雀水蚤(Parvocalanuscrassirostris) 是热带、亚热带以及温带海域广泛分布的桡足类, 分布区域从北部的渤海延伸至南海的北部湾海域[18-21]。强额孔雀水蚤具有适口性好、营养齐全和繁殖周期短的特点，这意味着，强额孔雀水蚤可以为幼鱼提供满足生长与发育所必需的能量与物质[22-23]。因此，强额孔雀水蚤在中国近岸食物网中扮演着重要的角色。目前对桡足类摄食棕囊藻的研究已经有许多报道[24]。其中，有研究指出柱形宽水蚤(TemoraStylifera)以球形棕囊藻为食会影响产卵量而不影响存活[25]。也有研究指出，摄食球形棕囊藻会影响长角宽水蚤(Temoralongicornis)无节幼体的正常生长发育[26]。此类研究都发现了球形棕囊藻会对桡足类产生消极影响的现象，但是，关于强额孔雀水蚤摄食棕囊藻的研究缺乏报道，有待开展研究。

根据捕食者-被捕食者之间的粒级关系, 虽然强额孔雀水蚤不能够有效地摄食囊体直径较大的(>30 μm)球形棕囊藻，但是从球形棕囊藻囊体释放出来的游离细胞和直径较小(<30 μm)的囊体是可以被强额孔雀水蚤摄食的[24,27]。球形棕囊藻具有两种不同的生活史：游离单细胞态和囊体态，球形棕囊藻赤潮一般以囊体态爆发，囊体态的球形棕囊藻超过80%是二倍体细胞[28]。基于强额孔雀水蚤在近岸海域的重要角色以及球形棕囊藻赤潮的发生可能对其产生潜在的负面影响，利用球形棕囊棕二倍体单细胞与强额孔雀水蚤开展实验，探讨球形棕囊藻赤潮对强额孔雀水蚤的影响是有必要的。

本研究以球形棕囊藻作为食物投喂强额孔雀水蚤，测定强额孔雀水蚤的死亡率、产卵量及其脂肪酸组分，并利用3种常见的微藻：球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)作为对比食物。探讨摄食球形棕囊藻对强额孔雀水蚤生长和繁殖的影响，以期揭示发生球形棕囊藻赤潮对桡足类强额孔雀水蚤存在的危害，为评价和预测球形棕囊藻赤潮对热带以及亚热带近岸海域生态系统造成的影响提供可靠科学依据。

1 材料与方法

1.1 微藻的来源

实验所使用的球形棕囊藻、球等鞭金藻、威氏海链藻和牟氏角毛藻均由北部湾海洋微藻资源库提供。藻类培养用f/2培养液[29]，置于恒温培养室中，温度为20±1°C，盐度为30±1，光照强2000 Lux，光暗比为12 h:12 h。

1.2 桡足类培养

强额孔雀水蚤于2018年9月份采集自北部湾近岸海域的钦州湾，利用浅水II型浮游生物网(网长: 140 cm，网口面积: 784.27 cm2，网的孔径: 0.160 mm)由底层向上垂直拖网，采集到的浮游动物暂养于20 L的塑料桶中，迅速转移到实验室。将活力较强的强额孔雀水蚤成体(体长在0.4～0.6 mm之间)从浮游动物样品中分离出来，放在5 L的塑料瓶中单独培养，温度为20±1°C，海水盐度为30±1，光暗比为12 h:12 h，投喂的饵料为球等鞭金藻，每两天投喂一次，食物量的碳含量浓度大概维持在1000 μg C/L。每个星期换水以除去瓶子底部的粪便颗粒以及食物残渣，保证水质环境优良。

在实验开始前将强额孔雀水蚤分别转移到不同饵料食物的培养组中，投喂相同的食物量，为了消除实验前的饵料食物产生的影响，此过程持续的时间为强额孔雀水蚤的一个世代周期(30 d)[24]。球形棕囊藻单细胞是由含有囊体的球形棕囊藻培养液经10 μm筛网在自然重力的条件下过滤连续两次获得，此操作是为了去除囊体结构，以获得球形棕囊藻的2倍体单细胞[28]。通过流式细胞仪进行验证所获得的球形棕囊藻单细胞为2倍体细胞。其余食物组的微藻饵料则是直接投喂，作为饵料食物所用的藻类都处于指数生长阶段。各食物实验组的饵料细节信息见表1。饵料微藻的细胞碳含量计算方法参照Reynolds的文献中的叶绿素与碳含量之间的比值[30]。强额孔雀水蚤的食物碳含量维持在1000 μg C/L。

表1 强额孔雀水蚤的微藻食物

1.3 强额孔雀水蚤雌体的产卵量以及强额孔雀水蚤无节幼体和桡足幼体的存活率

从各个饵料食物培养组的瓶子里随机挑选出强额孔雀水蚤5对雌雄个体，每两天投喂一次，食物量的碳含量浓度大概维持在1000 μg C/L。每隔8 h通过尼康倒置显微镜检查每隔培养皿底部的卵，记录每个组的累计产卵量。把卵收集起来放到新的培养皿，再投以相同的饵料以及相同的食物量。孵化后的无节幼体重新分离到新的培养皿，每天记录存活的个数，当有个体生长发育到达桡足幼体阶段再把它转移到一个新的培养皿，同样记录每天的存活率，具体的实验操作参照Alajmi 等的方法[23]。实验过程中，每两天更换一次容器内的海水以除去食物残渣和粪便颗粒，并加入新的藻液作为食物。

桡足类的死亡率的计算方法如下：

1.4 脂肪酸含量分析

从不同饵料食物组的瓶子里收集强额孔雀水蚤成体进行48 h的冷冻干燥，还有处于指数生长期的各种微藻食物也通过离心收集后冷冻干燥48 h。对所得样品进行脂肪酸甲酯化得到脂肪酸甲酯，具体的操作方法主要参照Morrison等人的实验[31]。脂肪酸甲酯的定量：利用安捷伦7890A-5975C型气质联用色谱仪组分进行分析，进样口温度为250°C，升温程序为：100°C升温至250°C，保持11 min，升温速率为10°C/min。色谱柱为HP-INNWWax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。内标采用正十九烷酸甲酯。脂肪酸的定性：利用保留时间与实验室获得的已知的数据进行比较，确定相对各个脂肪酸组分。脂肪酸的定量：通过比对内标正十九酸甲酯(methyl nonadecanoate, C19:0)的波峰面积确定各个组分的脂肪酸含量。以各个脂肪酸占总脂肪酸含量的百分比表示。

1.5 数据处理

实验结果以平均值±标准偏差(Mean±SD)的方式表示，组间的数据单因素方差分析利用(one-way ANOVA，P<0.05)进行统计处理，数据处理的软件利用SPSS 20.0。其中，存活率在进行方差分析前对数据采取正反弦数据转换。

2 结果分析

2.1 死亡率

不同食物组间的强额孔雀水蚤无节幼体阶段的死亡率存在差异(图1 A)，以球形棕囊藻食物组的死亡率最高，为65.93±4.18%。不同食物组下的强额孔雀水蚤的桡足幼体的死亡率表现出显著性的差异(P<0.05)，其中，球形棕囊藻食物组的死亡率显著高于其他的食物组，达到了69.74±6.50% (图1 B)。总体而言，由累积死亡率可以看出，强额孔雀水蚤的无节幼体阶段和桡足幼体阶段的最高死亡率都是出现在球形棕囊藻食物组，死亡率累积值达到了80.11±3.97%，显著高于其它的食物培养组(图1 C;P<0.05)。

图1 强额孔雀水蚤的死亡率

2.2 产卵量

由实验结果 (图2) 可知，以球形棕囊藻细胞培养的强额孔雀水蚤雌体的产卵量显著少于其它各个食物组(P<0.05)，平均的每日产卵量只有 1.28±0.79个。其次是以威氏海链藻培养的强额孔雀水蚤的雌体的产卵量，日平均产卵量有 3.14±1.87个，明显高于球形棕囊藻食物组的平均日产卵量(P<0.05)；而牟氏角毛藻食物组的日产卵量平均值为 7.70±3.53个，明显高于球形棕囊藻食物组的平均每日产卵量(P<0.001)；日平均产卵量最多的是球等鞭金藻食物组的强额孔雀水蚤雌体，为 10.34±5.83个，显著高于球形棕囊藻食物组的平均日产卵量(P<0.05)。

图2 强额孔雀水蚤的雌体阶段的日平均产卵量

2.3 脂肪酸分析

以牟氏角毛藻、威氏海链藻、球形棕囊藻和球等鞭金藻为食物培养的强额孔雀水蚤的脂肪酸成分分析结果如表2所示。可以看出，球形棕囊藻食物组的强额孔雀水蚤的总脂肪酸含量最低只有9.04mg/g，各个食物组的强额孔雀水蚤的总脂肪酸(TFA)含量高低的排列顺序为：Iso > TW > Cht > PG；单不饱和脂肪酸 (MUFA)含量高低的排序为：TW > Iso > Cht > PG；而多不饱和脂肪酸(PUFA)的含量高低排序与单不饱和脂肪酸的高低排序相同为：TW > Iso > Cht > PG。脂肪酸的分析结果还表明，以球形棕囊藻培养的强额孔雀水蚤的脂肪酸成分主要是：C14，C16，C16:1ω9，C18，这几种脂肪酸占到总脂肪酸总含量的75.43%。另外，其ω3系列和ω6系列脂肪酸含量分别只有2.81%和9.38%。特别值得指出的是，以球形棕囊藻培养的强额孔雀水蚤的脂肪酸成分并没有检出C20:5ω3(EPA, 二十碳五烯酸)，且C22:6ω3(DHA, 二十二碳六烯酸)的含量仅为 2.81%。从整体上看，PUFA仅占有总脂肪酸的12.19%，最多的是饱和脂肪酸(SAFA)，占有61.53%，其次就是MUFA，占有26.28%，如(图3B)所示。

表2 不同食物喂养的强额孔雀水蚤的脂肪酸组成成分

通过测定微藻食物的脂肪酸组成成分相对含量发现，球形棕囊藻(如表3所示)并没有检测出C20:5ω3(EPA, 二十碳五烯酸)和C22:6ω3(DHA, 二十二碳六烯酸)，而且PUFA含量只有5.6%。与其他的三种微藻食物的脂肪酸组分对比可以看出，球形棕囊藻的总脂肪酸含量最低，为(11.69 mg g-1dw)，其中，PUFA占比最低，为5.6%，主要以SAFA为主，占有比例超过了50%(如图3A)。在四种微藻食物中，球等鞭金藻的总脂肪酸含量最高，为(101.17 mg g-1dw)，其中，PUFA的占比达到了49.01%。

表3 微藻食物的脂肪酸组成成分

图3 微藻食物(A)和桡足类强额孔雀水蚤(B)的脂肪酸种类组成

3 讨论

PUFA是桡足类自身无法直接合成却又属于生长与繁殖所必需的物质，例如ω3系列和ω6系列的脂肪酸[32]，特别是EPA和DHA，与桡足类的存活率和产卵量有直接联系[33-35]。在本实验中，球形棕囊藻食物组的强额孔雀水蚤的死亡率要高于其它食物组。而且，球形棕囊藻食物组的强额孔雀水蚤的产卵量低于其它食物组。Verity与Smayda的研究发现，汤氏纺锤水蚤(Acartiatonsa)和哈德逊纺锤水蚤(Acartiahudsonica)摄食波切棕囊藻会导致其产卵量的下降[36]。 此外，Tang等人的研究发现，摄食球形棕囊藻不仅会导致汤氏纺锤水蚤(A.tonsa)的产卵下降，还阻碍了无节幼虫的正常发育[37]，本研究的结果与前人的研究相似。由微藻食物的脂肪分析结果表明，球形棕囊藻的脂肪酸成分中PUFA的含量较少，尤其是缺少EPA和DHA(表3)。一般来说，食物的PUFA含量低意味着食物的营养价值也低[38]，Claustre 等人的实验结果指出了球形棕囊藻是一个PUFA含量低的食物，而桡足类需要尽可能多地摄食球形棕囊藻才能满足自身的新陈代谢和繁殖所需[37,39-40]。同时，球等鞭金藻是强额孔雀水蚤的优质食物[23]，其脂肪酸组分中PUFA的含量较多，达到了49.01%(表3)。球等鞭金藻食物组的强额孔雀水蚤的产卵量显著高于球形棕囊藻食物组(p<0.05)，且死亡率显著低于球形棕囊藻食物组(P<0.05)。这表明，强额孔雀水蚤的高死亡率以及低产卵量与球形棕囊藻的低营养价值有关系。

在球形棕囊藻的脂肪酸成分中，C14:0， C16:0和 C18:0占到总脂肪酸含量的51.73%。在所有脂肪酸种类中，C18:1ω9的含量最高，占比达到25.47%(表3)。类似地，已有研究表明，C14:0， C16:0和 C18:0是棕囊藻的特征脂肪酸[39,41]，在爱尔兰海(The Irish Sea)的棕囊藻赤潮中也检测出有较高含量的C18:1ω9[39]。这与本研究所检测出的球形棕囊藻的脂肪酸组分相符合。脂肪酸是一种较为稳定的生物标记物，经生物消化吸收后其结构可以基本保持不变，可以用于辨别生物饵料的来源[33]。通过检测桡足类强额孔雀水蚤的脂肪酸组分发现，球形棕囊藻食物组的强额孔雀水蚤的脂肪酸组分与球形棕囊藻的脂肪酸组分相似(图3)，以SAFA为主要的成分，PUFA占比较少。需要注意的是，ARA(C20:4ω6)是强额孔雀水蚤的脂肪酸中占比最多的PUFA(表2)。对于ω6系列的长链不饱和脂肪酸，甲壳动物一般无法自身合成，需要从摄食的食物种获取[42]。而这与球形棕囊藻所含有的脂肪酸组分特征相对应(表3)，在球形棕囊藻的脂肪酸组分中，ARA是其含量最高的PUFA种类。可以推测，强额孔雀水蚤的脂肪酸含量低是由于摄食球形棕囊藻造成的。

4 结论

摄食球形棕囊藻造成了强额孔雀水蚤无节幼体和桡足幼体的存活率下降，成年雌体的产卵量下降，成体体内的PUFA含量变低。可以推测，当球形棕囊藻赤潮爆发的时候，单一的浮游植物种群大范围地占据了优势地位，强额孔雀水蚤可能会因为摄食了球形棕囊藻而使得种群的繁殖与增长受阻，个体的营养质量也会因此下降。因此，发生球形棕囊藻赤潮会可能会对强额孔雀水蚤以及以强额孔雀水蚤为食的其他海洋生物造成负面的影响。研究结果可以为全面评估近海的球形棕囊藻赤潮对桡足类结构群落产生的影响提供科学的参考资料。