LINC00665通过靶向miR-708-5p/DKK3抑制食管癌细胞的增殖及侵袭

吕翠婷，尹 情，韩俊淑，董稚明，郭 炜，沈素朋，梁 佳，郭艳丽

我国食管癌的发病率和病死率均较高，90%为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[1]。2018年WHO公布的癌症报告显示，我国食管癌患者总数约占全球食管癌患者的1/2。目前我国在ESCC的诊断和治疗方面虽然有了很大进展，但ESCC患者的治疗效果以及远期预后仍不理想，5年生存率不足20%[2]。近年来大量文献报道，长链非编码RNA(lncRNA)的异常表达与多种肿瘤的发生及进展密切相关[3-5]。LINC00665在乳腺癌[6-7]、前列腺癌[8]、胃癌[9]、胶质瘤[10]、结肠癌[11]、骨肉瘤[12]中均异常表达，并可通过多种机制参与肿瘤的发生、发展，但其在ESCC中的作用及机制尚未完全阐明。本实验着重探讨LINC00665在ESCC组织及细胞中的表达情况，分析其异常表达对ESCC细胞增殖、侵袭能力的影响及其发挥作用的可能分子机制，为ESCC患者的临床靶向治疗提供候选分子标志物。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2012～2015年河北医科大学第四医院生物样本库存档的98例ESCC标本，所有患者术前均未行放、化疗。每例标本均同时切取癌组织原发灶及距癌组织2～5 cm处的癌旁组织，一部分手术切除标本保存于-80 ℃低温冰箱中，用于RNA的提取，另一部分进行石蜡包埋，行常规HE染色，经病理医师诊断证实癌组织均为ESCC，癌旁组织均为正常黏膜组织。本实验经河北医科大学第四医院伦理委员会审查通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 细胞株及试剂ESCC细胞株Kyse150、Kyse170、Eca109、TE13、TE1由河北医科大学第四医院生物样本库留存并传代。Trizol总RNA提取液、Lipofectamine 2000转染试剂和PARIS均购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒(Reverse Transcription System A3 500)、双荧光报告基因检测试剂盒和MTS试剂均购自美国Promega公司；RPMI-1640细胞培养基购自美国Gibco公司，Transwell小室及Matrigel胶购自美国Corning公司；miR-708-5p mimics购自中国GenePharma公司。本实验所用引物均由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1细胞培养及转染 Kyse150、Kyse170、Eca109、TE13和TE1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37 ℃ 5%CO2的加湿培养箱中培养。取对数生长期且细胞状态良好的TE13细胞，常规消化并接种于6孔板中(2×105个/孔)继续培养，待细胞生长汇合度达70%～80%时，按照Lipofectanine 2000转染试剂说明书分别将pcDNA3.1-LINC00665、阴性对照(negative control, NC)或miR-708-5p mimics及相应阴性对照(miR-NC)进行转染。

1.3.2qRT-PCR法检测LINC00665及miR-708-5p的表达 按Trizol试剂说明书提取组织及细胞株中总RNA，参照Promega的逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA，用于检测LINC00665及miR-708-5p的表达，并以GAPDH或U6作为内参照。LINC00665引物序列：上游5′-GGTGCAAAGTGGG AAGTGTG-3′，下游5′-CGGTGGACGGATGAGAAA CG-3′。结果采用相对定量法，目的基因的相对表达量用2-△△Ct表示，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt -ΔCt对照。

1.3.3MTS实验检测TE13细胞的增殖能力 将每毫升3×103个TE13细胞接种于96孔板中，每组设置6个复孔。分别于细胞贴壁后0、24、48、72和96 h时在每孔加入20 μL(500 μg/mL)MTS试剂，在37 ℃ 5%CO2的加湿培养箱中培养2 h。用酶标仪在490 nm波长处检测每孔的吸光度。实验重复3次。

1.3.4Transwell侵袭实验检测TE13细胞的侵袭能力 常规消化并悬浮TE13细胞于无血清培养基中，调整细胞密度接种于小室上腔(1×105个/孔)，下腔加入含10%FBS的600 μL RPMI-1640。培养24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，并用0.1%结晶紫染色，显微镜下计数5个随机视野的细胞数。实验重复3次。

1.3.5双荧光素酶报告基因分析 将含有LINC00665与miR-708-5p结合位点区域片段插入荧光素酶报告基因载体pmirGLO构建pmirGLO-LINC00665报告基因质粒。同样用含有DKK3基因3′UTR序列片段(含有miR-708-5p结合位点)构建pmirGLO-DKK3报告基因质粒。将相应质粒共转染TE13细胞后，继续培养48 h，收集细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统测定相对荧光素酶活性。实验重复3次。

1.3.6亚细胞定位检测 根据PARIS试剂盒说明书，从TE13细胞中分离出细胞质和细胞核RNA，反转为cDNA后进行qRT-PCR分析，以确定表达LINC00665的亚细胞分布情况。GAPDH为胞质表达的内参照，U6为细胞核表达的内参照。

1.3.7数据库的应用 分别应用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)及Starbase V3.0(https: //starb ase.sysu.edu.cn/)数据库分析LINC00665、miR-708-5p在食管癌组织及正常组织中的表达情况；应用在线网站LncBase(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/page&view=software)分析可能与LINC00665结合的miRNA；应用Starbase V3.0、miRDB(http://mirdb.org/)、TargetScan 7.1(https://www.targetscan.org/vert_71/)、RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)网站预测miR-708-5p的潜在靶基因。

2 结果

2.1 ESCC及癌旁正常组织中LINC00665的表达qRT-PCR检测结果显示，ESCC组织中LINC00665的表达量为3.834±2.016，明显低于癌旁正常组织(7.973±2.752)，差异有统计学意义(t=12.011，P<0.001，图1A)。与癌旁正常组织相比，98例ESCC组织中86例LINC00665表达下调，其中56例表达下调达50%以上(图1B)。GEPIA数据库分析结果同样显示LINC00665在食管癌组织中表达下调(图1C)。此外，LINC00665表达与ESCC淋巴结转移、浸润深度及TNM分期有关(P均<0.05，表1)。

表1 LINC00665表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系

图1 A.qRT-PCR法检测食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织中LINC00665的表达；B.98例食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中LINC00665表达量的比值：>1表达上调；<1表达下调；C.GEPIA数据库分析LINC00665在食管癌组织及相应癌旁正常组织中的表达

2.2 LINC00665对ESCC细胞增殖及侵袭能力的影响qRT-PCR检测Eca109、TE1、TE13、Kyes150、Kyse170细胞株中LINC00665的表达情况，对照组采用10例食管正常黏膜组织cDNA的等比例混合物(Pools)。结果显示ESCC细胞株中LINC00665的表达量均低于对照组(P<0.05，图2A)。在LINC00665表达量最低的TE13细胞中转染LINC00665过表达质粒pcDNA3.1-LINC00665，qRT-PCR检测转染效率，结果显示质粒转染后LINC00665表达量显著升高(P<0.001，图2B)。分别应用MTS及Transwell小室侵袭实验检测LINC00665对TE13细胞增殖及侵袭能力的影响，发现过表达LINC00665可明显降低TE13细胞的增殖(P<0.05，图2C)及侵袭能力(P<0.05，图2D)。

图2 LINC00665对食管鳞状细胞癌细胞增殖及侵袭能力的影响：A.LINC00665在Eca109、TE1、TE13、Kyes150、Kyse170细胞中的表达水平；B.qRT-PCR检测TE13细胞中pcDNA3.1-LINC00665的转染效率；MTS及Transwell小室侵袭实验检测LINC00665对TE13细胞增殖(C)及侵袭(D)能力的影响

2.3 LINC00665与miR-708-5p的相互作用研究发现lncRNA可在细胞质中通过海绵吸附miRNAs而调控miRNA靶基因的表达，即为竞争内源性RNA机制(ceRNA机制)。qRT-PCR检测结果显示，LINC00665主要表达于细胞质(图3A)。在线生物信息学分析网站LncBase预测显示，miR-708-5p与LINC00665有潜在的结合位点(图3B)。因此，为进一步探讨LINC00665通过miR-708-5p发挥ceRNA机制的可能性，依据Starbase V3.0数据库分析162例食管癌及11例癌旁正常组织中miR-708-5p的表达情况，结果显示食管癌组织中miR-708-5p表达明显上调(图3C)。同时发现转染pcDNA3.1-LINC00665可明显降低TE13细胞中miR-708-5p的表达水平(P<0.05，图3D)；双荧光素酶报告基因检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-708-5p mimics组能明显降低pmirGLO-LINC00665组细胞的荧光素酶活性(P<0.05，图3E)。表明LINC00665与miR-708-5p有结合作用。

图3 LINC00665竞争结合miR-708-5p：A.qRT-PCR检测LINC00665在TE13细胞中的亚细胞分布情况；B.LncBase网站预测LINC00665与miR-708-5p的结合位点；C.Starbase V3.0数据库分析食管癌及正常组织中miR-708-5p的表达；D.qRT-PCR检测LINC00665过表达对miR-708-5p表达的影响；E.双荧光素酶报告基因检测miR-708-5p过表达对报告基因荧光活性的影响

2.4 LINC00665竞争性结合miR-708-5p对DKK3基因表达的影响运用多个生物信息学数据库(Starbase V3.0、miRDB、TargetScan 7.1和RNA22)预测miR-708-5p的潜在靶基因(图4A)。交集后评分较高的DKK3是经典Wnt/β-catenin通路的拮抗基因。本实验选取DKK3作为靶基因进行分析。图4B显示DKK3与miR-708-5p的结合位点。同时，本实验结果显示，转染miR-708-5p mimics明显降低DKK3基因的表达水平(图4C)；双荧光素酶报告基因结果亦显示，miR-708-5p过表达明显降低了含DKK3 3′UTR区结合位点片段报告基因质粒的荧光素酶活性(图4D)。结果表明DKK3是miR-708-5p的直接靶基因。

为证实LINC00665的ceRNA机制，进一步实施了回复实验。miR-708-5p过表达可抵消TE13细胞中由LINC00665过表达诱导的DKK3表达和报告基因荧光素酶活性的上调(图4E、F)。上述结果表明LINC00665通过靶向miR-708-5p/DKK3轴发挥ceRNA作用。

图4 LINC00665通过竞争性结合miR-708-5p靶向调控DKK3的表达：A.Starbase V3.0、miRDB、TargetScan 7.1和RNA22网站预测LINC00665靶基因的韦恩图；B.TargetScan 7.1预测miR-708-5p与DKK3的结合位点；C.miR-708-5p过表达对DKK3基因表达量的影响；D.双荧光素酶报告基因检测miR-708-5p过表达对DKK3报告基因荧光素酶活性的影响；E、F.miR-708-5p过表达部分挽救了LINC00665过表达引起的DKK3基因表达以及基因荧光素酶活性的上调

3 讨论

研究表明LINC00665在多种肿瘤中异常表达，但其发挥的功能具有肿瘤特异性，在不同肿瘤中可发挥抑癌或促癌基因作用[6-12]。本实验发现LINC00665在ESCC组织和细胞系中的表达均下调，并且其低表达与ESCC淋巴结转移、浸润深度和TNM分期密切相关。功能学实验结果显示，LINC00665在体外抑制了TE13细胞的增殖及侵袭能力。提示LINC00665在ESCC发生、发展中可能扮演着抑癌基因作用。

文献报道，LINC00665作为竞争性内源RNA(ceRNA)，可通过miR-379-5p/LIN28B轴、miR-1224-5p/SND1轴、miR-149-3p/RNF2轴、miR-9-5p/ATF1轴、miR-214-3p/PSMD10/ASF1B轴等分别参与乳腺癌[6]、前列腺癌[10]、胃癌[9]、结肠癌[11]、多发骨髓瘤[13]的恶性进程，提示ceRNA机制可能是该lncRNA发挥其功能的主要作用机制。lncRNAs的生物学功能依赖于其亚细胞定位，分布于细胞质中的lncRNAs能够通过海绵吸附miRNA发挥其ceRNA功能[3]。作者通过对LINC00665的亚细胞分布检测发现其在TE13细胞中也同样主要定位于细胞质，于是本实验着重从ceRNA角度探讨LINC00665抑制ESCC细胞增殖、侵袭能力的可能分子机制。通过生物信息学预测，发现miR-708-5p与LINC00665有潜在的结合位点。据文献报道，miR-708-5p的功能具有肿瘤特异性，在不同肿瘤中发挥着不同的功能。在膀胱癌[14]、结肠癌[15]中作为原癌基因促进了肿瘤的恶性进展；而在肝细胞癌[16]、卵巢癌[17]、肾细胞癌[18]中则发挥抑癌基因作用。而ESCC中miR-708-5p的作用则罕有报道，仅在Yang等[19]对113例ESCC标本进行检测发现miR-708-5p表达明显上调。Starbase V3.0数据库分析结果亦显示miR-708-5p在食管癌中表达上调。提示miR-708-5p在食管癌中可能发挥促癌基因功能。同时，研究显示，LINC00665过表达明显降低了TE13细胞中miR-708-5p的表达水平，结合双荧光素酶报告基因检测进一步证明了miR-708-5p与LINC00665的结合作用。提示LINC00665可能通过海绵吸附miR-708-5p发挥其生物学功能。

DKK3是经典Wnt/β-catenin通路的拮抗基因之一，通过结合Wnt的共受体LRP5/6使活化的受体复合物Wnt-Frizzled-LRP5/6无法形成，而特异性阻断Wnt/β-catenin信号通路[20]。目前研究结果证明miR-708-5p直接靶向DKK3。同时，通过回复实验及荧光素酶报告基因检测证明LINC00665通过竞争结合miR-708-5p靶向调控DKK3的表达，即LINC00665/miR-708-5p/DKK3轴的存在亦证实了LINC00665的ceRNA功能。

本实验结果显示LINC00665在ESCC组织和细胞中表达下调。LINC00665过表达可抑制ESCC细胞的增殖及侵袭能力，并可通过与miR-708-5p的竞争结合靶向调控DKK3基因的表达，进而影响食管癌患者的恶性进程。