食管鳞状细胞癌癌变过程中HPV16/18 E6蛋白与PIK3CA、PIK3CB突变的相关性及其临床意义

温菲菲，李扬扬，何 双，许晓阳，崔忠泽，路丽祯，吴淑华

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤[1]，患者生存率低[2]，预后差。目前认为绝大多数食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)来自鳞状上皮异型增生的恶变，即正常上皮→低级别异型增生(low-grade intraepithelial neoplasia, LGIN)→高级别异型增生(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN)→ESCC，其中由LGIN和HGIN演变为浸润癌的相对危险度分别为9.8和28.3[3-4]。病毒感染与肿瘤的发生密切相关，已有研究发现HPV感染与食管癌的发生密切相关[5]。HPV16和HPV18型病毒作为HPV中最常见的类型，主要通过抑制抑癌基因的功能促使细胞癌变[6]。HPV16/18 E6蛋白作为HPV感染后的早期癌蛋白，在HPV感染后病毒复制和细胞恶变的过程中发挥重要作用[7-8]。Ilahi等[9]采用免疫组化法检测HPV16/18 E6蛋白的表达并应用PCR检测HPV16、18的一致性高达85%。HPV16/18 E6蛋白能够准确反映HPV16、18病毒在体内的活性状态。本课题前期实验发现，在食管癌中PIK3CA、PIK3CB呈高表达[10]。然而，食管癌中HPV感染与PIK3CA、PIK3CB突变的相关性及其对食管癌发生、发展和预后的影响尚缺乏深入研究。本实验采用免疫组化法检测HPV16/18 E6蛋白、p53、PIK3CA和PIK3CB在食管正常黏膜、LGIN、HGIN及ESCC中的表达情况，探讨HPV16/18 E6蛋白、p53、PIK3CA和PIK3CB在食管癌癌变过程中所发挥的作用，为进一步分析食管癌的发生、发展机制和靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015年1月～2020年12月滨州医学院附属医院病理科存档的胃镜下黏膜下剥离术(endoscopic dissection, ESD)切除食管LGIN 35例，HGIN 34例。收集2009年1月～2011年12月手术切除的ESCC 137例，正常食管黏膜(距肿瘤旁≥5 cm)32例。根据WHO(2019)消化系统肿瘤分类标准[11]，所选病例切片由两位资深病理专家重新阅片，所有病例均为首次发现，术前均未行放、化疗。

1.2 试剂鼠抗人PIK3CA(克隆号ab5453)和PIK3CB(克隆号ab5559)抗体均购自Abcam公司；鼠抗人HPV16/18 E6(克隆号C1P5)抗体购自Santa Cruz公司；p53(克隆号DO-7)抗体、通用型二抗及DAB显色液均购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 采用免疫组化EnVision法染色：将切片脱蜡、水化，3%H2O2孵育30 min，高压热修复抗原，加一抗PIK3CA(1 ∶150)、PIK3CB(1 ∶250)、HPV16/18 E6(1 ∶200)、p53(即用型工作液)4 ℃过夜，加二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为空白对照，用已知HPV16/18 E6阳性的子宫颈癌组织切片、已知p53阳性的子宫浆液性癌组织切片、已知PIK3CA蛋白阳性的脑组织切片、已知PI3KCB蛋白阳性的扁桃体组织切片作为阳性对照。

1.3.2结果判断 HPV16/18 E6、p53阳性主要位于肿瘤细胞胞核，PIK3CA、PIK3CB阳性主要位于肿瘤细胞胞质。采用双盲法在每张切片上随机观察10个高倍视野(400×)。每视野计数100个肿瘤细胞，根据细胞染色强度和阳性细胞比例评判实验结果。按胞质或胞核发现淡黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞标志。染色强度：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分(染色深浅与背景着色相对比)；阳性细胞百分比：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；将两项得分相乘作为最终分数。对于PIK3CA、PIK3CB、HPV16/18 E6蛋白的评分≤4分为阴性，>4分为阳性；对于p53，当评分为2～8分时p53的判定为阴性，当评分为0～1或9～12分时p53判定为阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，不同分组间蛋白的表达差异及各蛋白表达与临床病理因素之间的关系采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，Log-rank法比较统计学差异，Cox回归模型确立影响预后的独立因素；不同分组间蛋白之间的表达相关性采用Spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC癌变过程中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB的表达HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB蛋白在食管正常黏膜组、LGIN组、HGIN组及ESCC组中呈不同程度的阳性(表1，图1～4)。HPV16/18 E6蛋白在食管正常黏膜组、LGIN组、HGIN组、ESCC组的阳性率分别为0、8.6%、26.5%、29.9%；统计分析结果显示，HPV16/18 E6蛋白在ESCC组与HGIN组中的表达高于食管正常黏膜组和LGIN组，差异均有统计学意义(P均<0.05)，LGIN组与食管正常黏膜组、HGIN组与ESCC组相比，蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。p53蛋白在食管正常黏膜组、LGIN组、HGIN组、ESCC组中的阳性率分别为9.4%、28.6%、50.0%、68.6%；统计分析显示，p53蛋白在ESCC组中的表达高于食管正常黏膜组和LGIN组，差异均有统计学意义(P<0.05)，p53蛋白在HGIN组中的表达高于食管正常黏膜组，差异有统计学意义(P<0.05)，食管正常黏膜组与LGIN组、HGIN组与ESCC组相比，蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。PIK3CA蛋白在食管正常黏膜组、LGIN组、HGIN组和ESCC组中的阳性率分别为9.4%、17.1%、26.5%、25.5%；统计分析显示，PIK3CA蛋白在ESCC组中的表达高于食管正常黏膜组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而食管正常黏膜组与LGIN组、HGIN组，ESCC组与LGIN组、HGIN组，两两相比，蛋白表达差异无统计学意义(P均>0.05)。PIK3CB蛋白在食管正常黏膜组、LGIN组、HGIN组、ESCC组的阳性率分别为6.3%、14.3%、23.5%、21.9%；统计分析显示，PIK3CB在ESCC组中的表达高于食管正常黏膜组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而食管正常黏膜组与LGIN组、HGIN组，ESCC组与LGIN组、HGIN组，两两相比，蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 食管鳞状细胞癌癌变过程中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB的表达差异

图1 A.HPV16/18 E6在正常黏膜中呈阴性；B.HPV16/18 E6在食管低级别异型增生部分细胞核中呈阳性；C.HPV16/18 E6在食管高级别异型增生细胞核中呈阳性；D.HPV16/18 E6在食管鳞状细胞癌细胞核中呈阳性，EnVision法 图2 A.p53在正常黏膜中呈阴性；B.p53在食管低级别异型增生部分细胞核中呈阳性；C.p53在食管高级别异型增生细胞核中呈阳性；D.p53在食管鳞状细胞癌细胞核中呈阳性，EnVision法 图3 A.PIK3CA在正常黏膜中呈阴性；B.PIK3CA在食管低级别异型增生细胞质中呈弱阳性；C.PIK3CA在食管高级别异型增生细胞质中呈阳性；D.PIK3CA在食管鳞状细胞癌细胞质中呈阳性，EnVision法 图4 A.PIK3CB在正常黏膜中呈阴性；B.PIK3CB在食管低级别异型增生细胞质中呈弱阳性；C.PIK3CB在食管高级别异型增生细胞质中呈中等阳性；D.PIK3CB在食管鳞状细胞癌细胞质中呈强阳性，EnVision法

2.2 ESCC中HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB表达与临床病理特征的关系HPV16/18 E6蛋白在ESCC中的表达与肿瘤发病部位、分化程度、淋巴结转移具有相关性，其中在颈段与上段、分化程度高、无淋巴结转移的肿瘤中，HPV16/18 E6蛋白呈高表达，差异有统计学意义(P<0.05)。p53与肿瘤浸润深度、淋巴结转移有相关性，在浸润深度深、有淋巴结转移的食管癌中，其呈高表达，差异有统计学意义(P<0.05)。PIK3CA、PIK3CB表达与肿瘤淋巴结转移有相关性，在有淋巴结转移的ESCC中，两者呈高表达，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB与食管鳞状细胞癌临床病理特征的相关性

2.3 ESCC癌变过程中HPV16/18 E6与p53、PIK3CA、PIK3CB表达的相关性HPV16/18 E6与p53在ESCC组中的表达呈正相关(r=0.202，P=0.018)，在LGIN、HGIN组中无明显相关性(P>0.05)。HPV 16/18 E6与PIK3CA在HGIN组、ESCC组中的表达均呈正相关(r=0.368，P=0.021；r=0.198，P=0.018)，在LGIN组中无明显相关性(P>0.05)。HPV16/18 E6与PIK3CB在LGIN组、HGIN组、ESCC组中的表达均无明显相关性(P>0.05，表3)。

表3 食管不同病变组织中HPV16/18 E6与p53、PIK3CA、PIK3CB表达的相关性

2.4 HPV16/18 E6、p53、PIK3CA、PIK3CB表达与ESCC患者预后的关系137例ESCC患者中位生存时间为44个月，5年生存率为28.5%。HPV16/18 E6蛋白阳性与阴性患者的5年生存率分别为46.3%、20.8%(图5)；p53蛋白阳性与阴性患者的5年生存率分别为23.4%、39.5%；PIK3CA阳性与阴性患者的5年生存率分别为17.1%、32.4%。Kaplan-Meier分析结果显示，与ESCC预后相关的因素包括HPV16/18 E6、p53、PIK3CA和淋巴结转移(P<0.05，图5)。Cox多因素生存分析结果显示，影响ESCC患者预后的独立因素包括HPV16/18 E6、p53、PIK3CA和淋巴结转移，而患者年龄、性别、肿瘤体积、肿瘤分化程度、PIK3CB均非ESCC患者预后的独立因素(表4)。

图5 食管鳞状细胞癌患者Kaplan-Meier生存曲线：A.HPV16/18 E6蛋白表达与患者预后的关系；B.p53蛋白表达与患者预后的关系；C.PIK3CA蛋白表达与患者预后的关系；D.淋巴结转移与患者预后的关系

表4 食管鳞状细胞癌患者预后多因素生存分析

3 讨论

食管癌的发病率位居全球恶性肿瘤的第8位[12-13]。食管癌有多种组织病理学类型，其中90%为ESCC。ESCC的治疗方案主要是手术切除后辅以放、化疗，但晚期ESCC患者的预后仍然较差[14]。因此，迫切需要阐明食管癌的发病机制，寻找有效的靶向分子以预警食管癌的发生。

病毒感染与多数肿瘤的发生密切相关，如EB病毒与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤的发生有关。研究证实，HPV是多发性恶性肿瘤发生、发展的危险因素[15-17]。1982年Syrjanen[18]最早提出食管癌的发生可能与HPV感染有关。研究显示，HPV16、18感染是食管癌发生、发展的高危因素[19]。本实验发现，随着食管癌的发生、发展，即由正常食管组织→LGIN→HGIN→ESCC的过程中，HPV16/18 E6蛋白阳性率逐渐增高，表明在ESCC的进展过程中HPV16、18感染可能通过某种途径促进ESCC的发生。研究表明[6, 20]，HPV16/18 E6蛋白可与细胞内E6相关蛋白(E6-AP)形成复合物，特异性结合p53，抑制p53的抑癌作用，p53基因会发生失活或突变，通过促进下游靶基因的转录，诱导细胞停滞在G1期，使得癌细胞的增殖/凋亡比例失衡，致使ESCC进一步恶化。本实验结果亦显示，p53蛋白在ESCC组中的突变率高于食管正常黏膜组和LGIN组，在HGIN组中的表达高于食管正常黏膜组，且p53突变与肿瘤浸润深度、淋巴结转移密切相关。同时，在ESCC组中，HPV16/18 E6蛋白与p53突变呈正相关，而在LGIN、HGIN组中无明显相关性。作者认为，HPV16/18 E6蛋白在食管鳞状上皮异型增生阶段，可能并非通过激活p53通路，而是通过其他途径完成。在ESCC中，HPV16/18的持续感染通过非特异性激活p53通路，导致p53失活或突变，进而促进肿瘤的浸润和转移。

HPV的持续感染可导致多种信号通路异常激活[21-22]。其中，HPV感染可引起PI3K/Akt信号通路中多种细胞因子的异常激活，进而促进肿瘤的发生、发展[23]。Marquard等[24]研究发现，头颈部鳞状细胞癌中PI3K/Akt信号通路的异常激活与HPV感染密切相关，且与患者不良预后相关。Beaty等[25]研究发现PIK3CA突变与HPV相关的口咽鳞状细胞癌的化疗后无瘤生存期有关。Madera等[26]认为抑制PIK3CA表达和HPV感染可抑制口腔鳞状细胞癌的生长。本实验结果显示，PIK3CA、PIK3CB蛋白在ESCC组的表达高于食管正常黏膜组；并且PIK3CA、PIK3CB表达与ESCC淋巴结转移有关。作者认为，PIK3CA蛋白高表达可激活PI3K/Akt信号传导通路，使细胞快速生长，并失去分化成熟能力，同时，该通路的异常激活可能在促进血管形成、肿瘤上皮-间质转化及侵袭、转移中发挥作用。同时，在HGIN及ESCC组中，HPV16/18 E6蛋白表达均与PIK3CA呈正相关。作者推测，在食管HGIN向ESCC进展过程中，HPV的持续感染导致HPV16/18 E6蛋白表达上调，诱导肿瘤中PIK3CA突变，进而激活PI3K/Akt信号通路，诱导肿瘤的发生发展、侵袭及转移。因此，临床内镜筛查食管疾病时，可通过检测HPV感染并靶向治疗HPV感染，可能会减缓或阻止ESCC的发生、发展。

影响ESCC预后的因素众多。本组通过Kaplan-Meier生存分析结果表明，HPV16/18 E6、p53、PIK3CA及淋巴结转移均与ESCC患者预后密切相关。Cox多因素生存分析显示，HPV16/18 E6是提示ESCC良好预后的独立因素；p53、PIK3CA及淋巴结转移是ESCC预后的独立危险因素。作者认为，发生于食管颈段及胸上段、分化程度较高及无淋巴结转移的ESCC患者中，HPV16/18 E6蛋白阳性率更高，其可能是由于HPV16/18 E6蛋白过表达诱导的ESCC发生部位较高，患者自发症状较早，可早期获得治疗有关；而其诱导的肿瘤分化程度较高，且无淋巴结转移，也可能是HPV16/18 E6蛋白阳性患者预后较好的潜在原因。同时，HPV16/18 E6蛋白高表达可导致p53和pRB的失活或突变，促进基因组重排[27]，而DNA重排患者对放、化疗更敏感，使得HPV16/18 E6阳性肿瘤患者的生存率更高。

综上所述，在ESCC癌变过程中存在HPV16/18 E6蛋白、p53和PIK3CA、PIK3CB蛋白高表达，并且HPV感染与PIK3CA突变密切相关。因此，联合检测HPV16/18 E6蛋白和PIK3CA突变对ESCC的预后判断和优化治疗具有重要意义。然而，本实验仅对HPV16/18 E6蛋白和p53、PIK3CA、PIK3CB表达的相关性及其临床意义进行初步探讨，还需增加样本量进一步分析，并深入开展细胞、分子机制的分析，为临床靶向药物的选择提供可靠依据。