磁微粒化学发光法测定人尿液/血浆中儿茶酚胺类物质

庄路阳，许君艳，刘 念，王 丹，牛自飞

郑州安图生物工程股份有限公司，河南郑州 450000

嗜铬细胞瘤/副神经节瘤(PHEO/PGL)是一种少见的导致内源性儿茶酚胺过量的神经内分泌肿瘤，位于肾上腺的为PHEO，位于肾上腺外的为PGL[1-2]。除PHEO/PGL外，压力、长期使用安非他命等药物均可导致体内儿茶酚胺类物质水平过高[1,3-4]。儿茶酚胺类物质主要包括肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)等，过量儿茶酚胺可引起头痛、大汗、心悸、胸痛等症状，还可导致严重的心血管疾病[5-8]。由于PHEO/PGL的临床症状及体征不典型，极易导致误诊或漏诊，更多的PHEO通过偶然的影像学检查被发现[9]。目前常用的儿茶酚胺检测方法有放射酶学法、化学发光法、荧光法、高效液相色谱法(HPLC)等。放射酶学法技术难度高，检测速度慢且容易造成污染；荧光法灵敏度不够；HPLC存在检测时间长、不能批量操作等问题[10-13]。而《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》建议使用HPLC测定儿茶酚胺类物质[14]。基于此研究现状，本研究通过对含儿茶酚胺的尿液/血浆标本进行前处理，再利用磁微粒化学发光法对其进行检测，提高其检测灵敏度以及实现检测批量化、自动化，以满足临床检验的需求。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 全自动化学发光仪(Autolumo A2000 Plus)，安图生物工程股份有限公司；微孔板快速振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；移液器，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；电子分析天平，梅特勒托利多仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；79-1磁力加热搅拌器，江苏科析仪器有限公司。E纯品购自上海阿达玛斯试剂有限公司；NE、DA、3-甲氧酪胺(3-MT)、L-左旋多巴纯品(L-Dopa)纯品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氧基肾上腺素(MN)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)纯品购自上海柯维化学技术有限公司；E、NE、DA单克隆抗体、亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)、甲基转移酶(COMT)均购自郑州伊美诺生物技术有限公司；表面包裹有羧基功能基团的磁微粒购自德国Merk公司；二甲基亚砜(DMSO)购自北京益利精细化学品有限公司；硼酸亲和凝胶、(5′-腺苷)-L-甲硫氨酸对甲苯磺酸盐购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；Succinimidyl N-[6-(Biotinamido)hexanoyl]-6-amino hexanoate购自北京百灵威科技有限公司；24孔细胞培养板购自美国康宁公司。

1.2方法

1.2.1试剂配制 (1)校准品：校准品稀释液为pH=4的柠檬酸缓冲液(保护剂：0.2%的乙酰半胱氨酸)，加入不同水平的E、NE、DA纯品，制备出一组E水平为0、2、6、18、54、162 ng/mL，NE水平为0、10、30、90、270、810 ng/mL，DA水平为0、100、300、900、2 700、8 100 ng/mL的校准品。(2)抗体固相化：将选用的磁性微球原液经过10倍原液体积的磷酸缓冲液冲洗2～5遍后使用N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS)或戊二醛进行活化，分别与水平为0.3 μg/T的抗体通过化学连接进行包被，包被后的磁性微球经封保液封闭后，定容并分装，2～8 ℃环境保存备用。(3)亲和素标记的HRP溶液：首先按照配方三(羟甲基)氨基甲烷-氯化钠(Tris-NaCL)0.05 M、牛血清清蛋白(BSA)2%、氨基比林(ADP)1%、碘丙炔正丁氨甲酸酯(IPBC-II)1%、聚乙二醇-4000(PEG-4000)1%配制稀释液，再按照1∶5 000加入亲和素标记的HRP，得到亲和素-HRP溶液，混合均匀后2～8 ℃保存待用。(4)提取板：称取一定质量的顺式二醇特异性亲和介质于250 mL烧杯中，加入适量纯化水，振荡混匀，取一定体积，通过物理吸附使其均匀分布，氮吹或37 ℃烘干。(5)酰化剂：量取一定体积的DMSO，称取适量酰化剂，使其完全溶解，2～8 ℃保存待用。(6)甲基化酶溶液：分别取儿茶酚胺COMT冻干粉，加入3.75 mL的COMT缓冲液(1 M Tris-HCL、临用现配)。

1.2.2标本的前处理 (1)提取：吸取1 mL提取缓冲液(0.1 M Tris-NaCL，pH=9.18)于提取板中，再加入20 μL校准品或标本(尿液标本20 μL、血浆标本500 μL)，室温振荡反应30 min，甩干后用2 mL纯化水洗两遍，在吸水纸上拍干提取板；(2)酰化：取150 μL的提取缓冲液于提取板中，再加入50 μL酰化剂，振荡反应20 min，甩干，纯化水洗两遍，在吸水纸上拍干提取板；(3)释放：加入300 μL释放缓冲液(0.1 M柠檬酸缓冲，pH=3)振荡反应30 min；(4)甲基化：将上述300 μL液体转移至空白板，每孔分别加入300 μL的COMT溶液，振荡反应30 min，得到待检测抗原。

1.2.3标本检测 将处理好的校准品及标本转移至反应杯中，配套使用AutoLumo A2000 Plus全自动检测分析仪进行检测，得到抗体-抗原-HRP复合物，该复合物催化发光底物发出光子进行检测。用E、NE、DA的检测试剂分别检测处理好的系列校准品，并按照四参数拟合方式进行校准曲线的拟合，计算标本水平，其中尿液标本水平=计算水平，血浆标本水平=计算水平/25。

1.2.4校准曲线的拟合 采用E、NE、DA的检测试剂分别检测处理好的系列校准品，横坐标为校准品对应水平值，纵坐标为信号值取log，按照四参数法拟合剂量反应曲线，根据检测标本信号值回算其水平值。

2 结 果

2.1灵敏度及特异度 重复检测0水平的校准品20次，可得出E检测试剂的灵敏度为6.2 pg/mL，NE检测试剂的灵敏度为11.9 pg/mL，DA检测试剂的灵敏度为4.2 pg/mL。E、NE、DA之间相互交叉率均小于0.5%，与其他结构类似物(L-Dopa、3-MT、MN、NMN)交叉率均小于0.1%，见表1。

表1 检测试剂的特异度

2.2重复性 DA检测试剂的CV为1.30%～1.96%，NE检测试剂的CV为1.45%～3.65%，E检测试剂的CV为1.12%～1.77%，可以满足临床使用的一般要求(CV<10%)，见表2。

表2 不同水平标本的重复性

2.3稳定性 建立的E检测方法的偏差为-6.67%～-2.93%，建立的NE检测方法的偏差为-7.06%～-3.87%，建立的DA检测方法的偏差为-4.81%～-1.71%,偏差符合一般体外诊断试剂的标准要求，说明检测方法的稳定性较好，见表3。

表3 检测方法的稳定性

2.4稀释线性 DA的检测水平与理论水平相关曲线为Y=1.093 8X-129.17，R2为0.993 6；E的检测水平与理论水平相关曲线为Y=1.094 2X-0.995 4，R2为0.994 3；NE的检测水平与理论水平相关曲线为Y=0.967 1X+4.735 9，R2为0.997。3项R2均>0.99，具有较好的稀释线性。见图1～3。

图1 DA稀释线性评估结果

图2 E稀释线性评估结果

图3 NE稀释线性评估结果

3 讨 论

研究表明，PHEO/PGL可以导致严重的并发症，涉及心、脑、肾血管系统等，引起持续性或阵发性高血压，危及患者生命，但如能及时、早期获得诊断和治疗，90%的患者可以治愈。因此，检测血浆及尿液儿茶酚胺对临床诊断PHEO/PGL具有重要意义[15]。《嗜铬细胞瘤与副神经节瘤诊断治疗专家共识》推荐诊断PHEO/PGL首选血浆(游离)或尿液(游离与结合态)MN水平，可同时检测血浆或尿液 E、NE、DA等代谢物水平以帮助诊断[16]。

儿茶酚胺类物质检测方法从最初的放射酶学法、荧光法发展到现在的串联质谱法(LC-MS/MS)，LC-MS/MS因其高灵敏度、高特异度被广泛应用，但不同实验室的检测结果差异较大[17]，此外，由于儿茶酚胺类物质的半衰期极短，稳定性较差，因此各实验室间检测结果的一致性较差。

为了验证本次建立的检测方法的准确性，对检测试剂的灵敏度、特异度、重复性、稳定性及稀释线性进行了评估。本研究建立的化学发光免疫法检测试剂对待测物具有较高的特异度(与其结构类似物交叉率均<0.5%)，可以实现待测物的准确检测；E检测试剂的灵敏度为6.2 pg/mL，NE检测试剂的灵敏度为11.9 pg/mL，DA检测试剂的灵敏度为4.2 pg/mL，远低于健康人血浆和尿液中的水平，可以满足3项指标检测需求；且E、NE、DA低、中、高三种水平的重复性CV均<5%，确认了该检测系统具有较好的重复性；稀释线性评估的目的是为了检验检测试剂在一定量值区间内的检测准确度，结果显示，E<162 ng/mL、NE<810 ng/mL、DA<8 100 ng/mL时，3项的R2均>0.99，具有较好的稀释线性；稳定性评估结果显示，建立的DA检测方法的偏差为-4.81%～-1.71%，NE为-7.06%～-3.87%，E为-6.67%～-2.93%，偏差符合行业标准要求，3项指标检测方法具有较好的稳定性。本文建立的利用安图全自动化学发光仪的检测方法可实现血浆及尿液中E、NE、DA的特异性检测，可以通过进一步的研究，实现该试剂各项性能指标的优化，助力PHEO/PGL的诊断。