用于生物化学检测的微芯片量热计发展综述

2022-06-27张梅菊郭林琪张丛春

测控技术 2022年6期

金毅, 张梅菊, 苗青, 郭林琪, 张丛春*

(1.上海交通大学电子信息与电气工程学院微纳电子学系,上海 200240；2.航空工业北京长城航空测控技术研究所先进传感器技术中心，北京 101111;3.上海交通大学附属胸科医院,上海 200030)

大部分的化学反应和生物过程都会产生热量信号[1-2]，例如蛋白质折叠过程、促酶反应、蛋白质-核酸相互作用和生物分子-细胞相互作用。通过测量这些生化反应过程释放或吸收的热量，可以确定这些过程的热力学特性，这对蛋白质稳定性和其他生物化学研究有重要意义。量热计是基于量热法所制备的，是描述化学反应或生物过程的有效工具[3]。它可以检测蛋白质反应过程的相变温度和焓变，实时对反应的过程进行温度监控。用于生物化学检测的量热计不需要对反应物进行标记，可以避免给反应物带来干扰，故不会影响测量结果[4]。传统量热计尽管拥有很高的分辨率，但是存在材料消耗很大、检测时间长和体积过大等问题。并且大型量热计的量产也存在很大的问题，这都非常不利于生物层面的研究。美国TA仪器自1963年成立以来一直是热分析领域的技术佼佼者。图1(a)为TA仪器研制的Affinity ITC型等温滴定量热仪，图1(b)为TA仪器研制的Discovery DSC 25P型差示扫描量热仪。虽然两个量热仪对于实验室的检测而言，性能优越、操作方便，但是价格昂贵、体积巨大，并且携带性很差，在面对未来实验室外实验，以及便携性测量上都难以达到要求，开发微型化的量热计成为了迫切的需求。

图1 传统芯片量热计

在科学研究和工业应用中，对响应时间更短、样品消耗量更小的量热计的需求越来越大。MEMS技术的出现与发展成为传感器技术进一步发展的重要推进力。MEMS技术使量热计微型化、集成化、多功能化和量产化成为可能，同时使量热计消耗样品量更少且响应时间更短[5]。通过MEMS技术制成的量热计被称为芯片量热计或IC量热计[3]。近年来，有许多课题组发明了很多芯片量热计用于分析各类生化反应过程，例如酶催化反应[2-3,6-7]、活性蛋白肽变性过程[4,8-10]、碱基DNA链中核苷酸渗入[11-12]等。

本文综述了芯片量热计的发展、最新的结构设计、材料使用和制造技术。根据国内外科研团队研制的芯片量热计，就其设计要素和性能进行了归纳与讨论；介绍了目前芯片量热计主要的两类生物应用领域：生物分子间相互作用和检测细胞代谢活动；最后，对生物芯片量热计的发展提出了三点改进建议。

1 芯片量热计的设计与性能

芯片量热计的主要性能包括热导率、响应时间、灵敏度、分辨率和样品容量。图2为芯片量热计主要设计要素：量热法、传感方式、腔室结构和材料。不同设计要素的选择和搭配将会对芯片量热计的性能产生影响。国内外研究者基于这4个方面开展了传感器性能的改进和提升的工作。

图2 芯片量热计的主要设计要素

1.1 量热法

量热法是一种测量材料热学性能的技术，在测量过程中，只要涉及到热量和热容时都会应用到这个方法。大多数的生化反应都具有热活性，包括释放或者吸收热量。量热法得到的数据对进一步的科学探索有着重要的意义[1]。

大部分商用量热计主要使用两种量热方法，分别为差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry,DSC)和等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)。差示扫描量热法[2,8-9,13-14]监测样品和参考样品的功率差与温度变化的关系。样品和参考物放在两个完全相同的测量平台中，以一定速率对两个平台进行温度扫描，然后测得这个功率差与温度的变化关系。这种量热方法被广泛运用于蛋白质折叠和展开产生的吸热放热的研究中[2]。

等温滴定量热法[3-4,11，15]是在恒定温度下，用一种反应物逐次滴定在另一种反应物上，随着加入滴定液体的体积变化，测量反应区域温度的变化[4]。该方法能够在反应中获得大量信息，例如吉布斯自由能(G)、焓(H)、熵(S)等。它可应用于酶催化反应[3,6]、酸碱中和反应等中。

1.2 传感方式

量热计最直接测量的物理量是样品的温度。根据量热计对样品接触方式的不同，可将量热计分为3种类型，分别为直接接触型、半接触型、不接触型。直接接触型传感方式是将量热计上的传感元件直接与样品接触来测得温度。这样的热传感元件有热电偶[3,6,9,13,16-18]、热电阻[8,16,19-21]、电阻式温度传感器[22-23]、共振热传感器[24]和双材料微型悬臂梁[25-26]。半接触性传感方式是通过温度敏感材料间接测量样品的温度变化，例如量子点[26]、荧光[27]。不接触型传感方式中，传感器可以在距离样品较远的情况下测得样品的温度变化情况，例如红外测温仪[28]、X射线探测仪[29-31]。半接触型和不接触型温度传感器受限于制造难度和功能的局限性，难以实现量产和多用途性。时至今日，以微型电子元件为主体的直接接触型温度传感器依旧是芯片量热计的主流，本文主要介绍该类芯片量热计。

1.2.1 热电偶与热电堆

热电偶是基于塞贝克效应的温度传感元件。当有两种不同材料的导体组成回路时，只要两节点处的温度不同，回路中将产生一个热电动势。令一个热电偶的一个节点温度保持不变，那么通过产生的热电动势，即可得出另一个节点的温度。许多生化反应过程的热量释放非常微弱，这对热传感器的敏感度要求非常高，所以单单一个热电偶通常不足以测出这些温度变化。而通过增加热电偶的数量或者选择塞贝克系数差高的热电偶材料，可以实现极高的灵敏度。2005年，Baier等[3]在氮化硅衬底上制作了4个热电堆，每个热电堆上串联了118个Bi-Sb热电偶，使灵敏度达到了4～6 V/W。2009年Lee等[6]将5个Au-Ni热电偶呈辐射状串联起来制成热电堆,如图3(a)所示。2016年Jia等[9]在PI衬底上制作了有200个Bi-Sb热电偶的热电堆。2020年Harzheim等[17]使用单层石墨烯制造了一个只需要石墨烯一种材料的热电偶，如图3(b)所示，其原理为将石墨烯的线宽降低到纳米级别，从而改变了其塞贝克系数，使不同粗细的石墨烯产生较高的塞贝克系数差，产生热电偶的效果。其塞贝克系数差可以达到39 μV/K。

图3 热电偶量热计

热电堆具有优良的共模抑制比[32]和零偏移，可以实现高灵敏度。但是大量的热电偶不仅增加了制造难度，而且需要巨大的空间，同时带来的大量电阻也会增加噪声，降低灵敏度[33]。2018年Wang等[33-35]开发了简单悬臂梁量热计，两根悬臂梁上各有一个热电偶。每个热电偶由硅和Au/Cr组成。由于硅本身的塞贝克系数足够大，故与任何金属组成的热电偶都可以获得非常明显的塞贝克效应。2019年Wang等[7,36]又发明了一个单热电偶结构的桥式量热计，其灵敏度达到0.44 V/W，在电偶数量下降了1～2个数量级的情况下，灵敏度只下降了一个数量级。但是在器件制造方面，为了减小硅本身巨大的热导率，必须做成悬空且细长的悬臂梁结构来降低热量损失。

1.2.2 热电阻

热电阻传感器使用对温度敏感的电阻来测量温度信号。热电阻传感器的优势是它不需要串联大量的电阻，从而具有较小的体积并降低了电阻的噪声干扰，提高了灵敏度。

热电阻材料的电阻温度系数(Temperature Coefficient of Resistance，TCR)是一项非常重要的指标[37]。TCR较大，意味着材料对温度的敏感性也就越高[23]。2016年，Koh等[19]因V2O5拥有良好的TCR和低噪声，用其制作了一种薄膜热电阻(见图4(a))。同年，Wang等[16]制造了以氧化钒为热电阻材料的量热计，它的TCR为-2.8%/℃，用于监测液体蛋白质样品的展开特性。2017年，Wang等[16]发现氧化钒和氧化钛在较低温度下结合(见图4(b))能够有效提高TCR值，在经历退火处理后，最高的TCR值可以达到-2.51%/℃。

图4 热电阻量热计

热电阻相较于热电堆不需要外接电路，能够直接将温差转换成电压信号。热电阻在检测温度差时需要集成惠斯通电桥来获取温差信号，这使得在探测生化反应放出的微量热量时多了一步信号转换，这对热电阻的灵敏度和稳定性提出了更高的要求。

1.2.3 双材料悬臂梁

双材料悬臂梁量热方式是一种新的温度传感方式。这种微悬臂梁由两层不同膨胀系数的材料制成。当在悬臂梁附近放上热源，悬臂梁即会发生弯曲。通过计算悬臂梁弯曲程度可推导出温度的变化，这是一种间接测量方法。

2016年Voiculescu等[25]使用氮化硅和金制作了一种在液体中工作的双层薄膜微悬臂梁温度传感器(见图5(a))，使用加热器模拟动物脂肪细胞产生的温度变化。将其放置在悬臂梁的附近，使悬臂梁发生弯曲，根据挠度的不同得出温度值。同年，Khan等[26]使用氮化硅和铝制作了一种双材料微通道悬臂梁量热计(见图5(b))，用于检测亚纳升液体的热容。对于容量为150 pL的样品，灵敏度达到30.5 ms/(J·g-1·K-1)，响应时间只需要10 ms。同时测量了5种挥发性有机化合物的热容，都达到了理想的结果。

图5 悬臂梁量热计

1.2.4 谐振式热传感器

谐振式热传感器的测量原理是谐振器的谐振频率跟踪样品在温度变化时产生的热量变化。2012年Inomata等[38]开发了带有真空腔的谐振式量热计，这种结构可以防止热从谐振器中消散在周围的环境和水中，他们用其测量了单个脂肪细胞在没有刺激和有刺激情况下的放热情况。

1.3 腔室结构

用于生物分子液体传感的芯片量热计通常根据结构分为两种：开放型和闭合型，如图6所示。

图6 开放型和闭合型腔室结构

开放型量热计利用了空气的隔热性能，通过微量注射器或喷墨器直接将样品滴在检测区域的温度传感器上。2004年Chancellor等[13]制作了一种灵敏度达到6.34 V/W的基于氮化硅薄膜的开放型芯片量热计。Chancellor等使用喷墨打印技术将皮升量级体积的溶液滴在反应腔上，并测量了其化学反应和生物反应的焓变。2011年Lubbers等[4]使用20个Bi-Sb热电偶制成开放型腔室，为了防止热蒸发在传感器顶部，使用一层矿物油将其覆盖，测量时，注射头穿透矿物油向热电堆上滴上样品溶液，如图7(a)所示。Khaw等[39]也制作了一种用于检测蛋白质折叠和新陈代谢的开放型量热计。该量热计使用了红外探测传感器，实现了纳升量级的样品的测量与控制。2018年Wang等[33]开发了简单双悬臂梁热传感器，先在SOI衬底上制作了Si-Cr/Au热电偶，然后在正反两面进行刻蚀，制成了细长的悬臂梁，通过在悬臂梁顶端滴样品来检测信号。图7(b)为Wang等[2]制备的量热计，使用了PDMS制备的腔室作为其反应腔。

图7 两种腔室结构的量热计

闭合型腔室能够有效降低液体蒸发带来的不稳定性，并且可以控制样品体积，减小样品使用量。闭合型腔室需要有两个所有性能条件一致的腔室。其中一个作为样品测量腔，另外一个作为参考腔，用于提供温度参照，具有消除共模干扰信号的作用。2008年Wang等[2]使用PDMS材料制作了封闭腔室和微流道，并在两个腔室中间制作了空气缝隙结构，用以进行一定程度的隔热，避免两个腔室的热传导。2011年Adrega等[40]使用两层氮化硅薄膜研制了一种封闭腔室的量热计，这种设计使测量样品的体积可以下降到2.5 μL。2014年Davaji等[41]开发了一种三维全封闭的悬浮薄膜腔式量热计(见图8)。该热量计的腔室由氮化硅和聚酰亚胺组成，采用各向异性湿化学蚀刻工艺对反应室进行三维微机械加工，直接将腔室做在衬底上，每个腔室厚度只有几毫米，将反应腔的热质量降低了3个数量级，有效提升了灵敏度。但是闭合腔室量热计因为微流道系统的存在，其热导率的大小会影响液体的热量损耗，从而影响量热计的敏感度和准确度。为了减少样品的蒸发和传感器本身的热量损失，必须减小腔室体积，使用较低热导率的材料并改变量热计的整体结构。

图8 三维全封闭的悬浮薄膜腔式量热计

1.4 量热计材料

由1.3节可知，量热计的衬底和腔室材料的选择对于提高设备的隔热性能和灵敏度非常重要[42]。Khaw等[39]列出了用于制作微流体量热计的材料。表1将微热量计常用材料热性能与其他材料进行了对比[43]。表2展示了常用材料的加工方式、机械性能、生物相容性和耐化学性[39]。

表1 微热量计常用材料热性能与其他材料对比

表2 微热量计常用材料的加工方法、机械稳定性、生物相容性等

硅材料或其他的硅化合物材料具有成熟的微加工技术。这些材料具有较高的导热系数、较薄的厚度和较好的绝缘性能。尤其是氮化硅(Si3N4)，拥有优良的机械性能、耐腐蚀性、抗氧化性和抗热能力。2004年Chancellor等[13]开发的芯片量热计将氮化硅制成悬空薄膜，并在上面集成了Ti-Bi热电堆。

然而，使用硅材料作为悬空薄膜材料需要复杂的制作工艺，并且热导率相对较高，不利于量热计的隔热要求。硅的拉伸能力也较差，在使用过程中容易发生断裂现象。在这些方面，聚合物拥有更好的性能，例如PMMA[3]、PDMS[2,6,8,11]、派瑞林[6]、SU8[2-3]和聚酰亚胺[8-9]。相比于硅衬底，它们的热导率低了2～3个数量级，而且成本低、加工方式简单。

派瑞林是一种使用独特化学气相沉积形成的聚合物，具有优越的电绝缘性，以及抗酸、碱、腐蚀性气体、盐雾的能力，它能涂敷在各种形状的表面上，包括尖锐的棱边、裂缝和内表面。作为生物量热计中常用的材料，它还拥有很好的生物相容性，有利于对流体进行处理。2009年Lee等[6]使用派瑞林衬底制作了芯片量热计的微流道系统，灵敏度达到7.1 V/W，如图9(a)所示。并且因为派瑞林有很低的透气性和较高的机械强度，允许真空封装，故在其腔室上装载了一个真空腔，避免液体的蒸发。PDMS是有机硅的一种，生产成本低、加工工艺简单、鲁棒性好，有良好的生物相容性。2018年Wang等[8]开发的氧化钒热电阻量热计使用了PDMS结构，如图9(b)所示。然而，尽管PDMS有很多优点，但它在大多数有机溶剂中都会膨胀，这会使得在PDMS中检测的有机溶剂无法被处理。

图9 不同材料制备的量热计

PMMA又称为有机玻璃，是一种机械强度高、耐化学性强、杨氏模量高、断裂伸长率低的热塑性聚合物，具有较低的吸湿能力和良好的耐极端温度变化的能力。PMMA加工的方式很多，例如X射线曝光、激光加工成型等。在生物液体芯片热量计中，PMMA通常用作反应室的结构材料。

SU-8负光刻胶的主要成分为EPON树脂。作为结构材料的SU-8已被用于labs-on-chip和微量热计的设计和制作。它具有良好的化学相容性和生物相容性，也可用于表面保护，例如使用SU-8对微量热计表面进行平面化。SU-8光刻技术的成本远低于其他技术，如LIGA工艺(用于其他光刻胶)和深度反应离子蚀刻(用于硅)。

聚酰亚胺是综合性能最佳的有机高分子材料之一，耐高温达300 ℃以上，具有较高的杨氏模量，相比于其他材料，其拉伸性能出色。聚酰亚胺的低热导率(<0.12 W/(m·K))使其绝热性能非常优异。制备聚亚酰胺薄膜只需要少量的聚亚酰胺树脂，相比于其他衬底材料，成本更加低廉。2020年Huang等[44-45]研制的热电堆差示扫描热量计(见图10)通过甩胶的方式制备了厚度小于10 μm的聚亚酰胺薄膜衬底，其强韧性和绝热性为未来柔性生物量热计的研制提供了思路。

图10 使用聚亚酰胺薄膜作为衬底的芯片量热计

2 生物检测应用

2.1 生物分子间相互作用

在等温条件下，生物分子溶液的混合反应的操作、器件设计和制作相对来说更容易，所以这类方式的量热计应用更多。由纳米芯片量热计阵列组成的焓阵，牺牲了一定ITC仪器的准确性，实现了小型化和大规模的测量能力。2008年Recht等[46]使用焓阵列测量在单一配体浓度下的结合反应焓。除了蛋白质配体结合反应，焓阵还可以用来检测酶促反应、细胞体反应。2019年Lubbers等[47]基于ELISA研制的三明治结构量热计(见图11)进行了纳升体积的生物溶液的免疫分析，通过光谱法检测过氧化氢的消耗来测定过氧化氢酶的活性。

图11 三明治结构量热计

2018年Van Schie等[48]为了解决生物酶活动测量中因不完全混合而导致的样品释放热减少的问题，使用了一个芯片量热计，并且对使用方法进行了改进。与焓阵类似，这个设备可以用来测试葡萄糖氧化酶催化、蛋白质配体结合等生化反应。其他的酶反应还包括脲酶催化的尿素水解[6]、碱性磷酸酶将对硝基苯基磷酸盐转化为对硝基酚和磷酸盐的反应[48]。

2.2 细胞代谢活动监测

生物液体芯片量热计的另外一个应用就是检测微生物和动物细胞的代谢活动所产生的反应热[49]。2009年Garden等[50]用微流控系统在静态模式下测定了不同条件下大肠杆菌的活性。

笔者所在课题组研制了基于热电堆的芯片量热计，并对大肠杆菌的代谢反应进行了测定。先将空白培养基注入腔室，将此时的输出信号作为基线，随后进行两组对照实验。其中一组注入活性大肠杆菌UTI89，另一组是在其他条件不变的情况下注入经高温杀菌后的菌液。实验结果如图12所示，经过高温杀菌后菌液产生的输出电压非常小，与空白培养液产生的输出电压接近。对于注入活性菌液的实验，量热计的输出电压和基线的电压差保持在2.17 mV，体现出了芯片量热计探测微生物代谢过程产生的微小热量的能力。

图12 UTI89大肠杆菌代谢反应检测

2019年Lerchner等[51]将分流段技术与芯片量热计相结合，首次利用该技术研究了镰状细胞对人类红细胞代谢活动的影响。

除了微细胞体的研究，目前也有很多研究团队使用生物芯片量热计对微小生命体进行直接探测，例如使用量热传感技术对蠕虫种群活动的测量。2018年，Krenger等[52]使用热电堆量热计(见图13)，测量了由秀丽隐杆线虫幼虫种群(60～220个生物体)产生的代谢热信号。

图13 用于测量蠕虫种群活动的量热计

为了研究细胞在自然状态下产热特性，避免量热计对细胞的干扰，2020年Sato等[53-54]研制了一款双材料悬臂梁非接触式量热计(见图14)。通过测量因温度变化导致的悬臂梁弯曲来反应细胞变化。测量了4～7个小鼠棕色脂肪细胞在肾上腺素的刺激下的温度变化和耗氧量。

图14 双材料悬臂梁

3 生物芯片量热计研究发展建议

在调研国内外生物化学芯片量热计研究动态的基础上，对未来生物化学芯片量热计的发展方向提出以下几点建议。

① 以热电堆而言，其接下来的研究重点主要是如何提升小尺寸下的热电偶密度，从而提升热电堆的总塞贝克系数差。如图15所示，相较于传统应用于量热计的in-plane结构热电堆，cross-plane[55]热电堆提供了一个改进思路。它充分利用了纵向的空间，将冷热截点分别置于顶部与底部，从而增加了在相同面积内冷截点或热截点的数量。图15中，黑色、蓝色虚线框分别表示热截点和冷截点。

图15 in-plane结构热电堆和cross-plane结构热电堆

② 继续优化热电材料，尤其是各类非硅材料、非单质金属和半导体材料等，以从塞贝克系数、导电率等热电材料重要参数方面提高器件的工作性能。例如，化合物Bi2Te3和Sb2Te3在常温下有更高的塞贝克系数。但采用不同的制备方法(如磁控溅射、电化学沉积和蒸镀等)会直接影响量热计性能的优劣[56-57]。本课题组使用电化学脉冲沉积法制备了Bi2Te3和Sb2Te3，前者塞贝克系数为-53.73 μV/K，后者为96.62 μV/K，相较于传统金属热电材料有明显的性能优势。

③ 生物样品通常是在液体环境中的，这会导致许多在固体样品中不会产生的问题(如生物相容性、液体腐蚀等)。随着生物传感器的发展，基于PDMS材料的微流道不断得到应用。PDMS是一种有机硅，它拥有生产成本低、加工工艺简单、鲁棒性好、热导率低和生物相容性好的优点，将其应用于腔室的制备将会进一步克服蒸发、散热和密封等问题[58]。