孕期慢性缺氧对子代大鼠心脏损伤及氧化应激水平的影响＊

宫内慢性缺血缺氧为中枢神经系统和心血管疾病的起源和发展提供了强大的刺激。宫内缺血缺氧可由妊娠母体的不同疾病状态如贫血、妊娠糖尿病、妊娠高血压等引起。母体产前的缺血缺氧导致胎儿获得氧和能量减少，引起宫内生长受限，导致子代以后患心血管疾病的易感性增加；如罹患 缺血性疾病，其心肌损伤程度也更重[1]。其机制主要与宫内缺血缺氧改变子代肾素血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)的发育有关[2-3]。妊娠期缺氧的子代大鼠成年后心脏RA活化[4]进而激活下游细胞外调节蛋白激酶1/2进而上调胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的合成，导致心肌纤维化[5]。已有研究探讨宫内慢性缺氧与雄性后代主动脉功能的关系，该研究表明，宫内缺氧导致主动脉中的SOD和GSH-Px活性降低，同时增加血管对去甲肾上腺素的血管收缩剂反应，降低对乙酰胆碱的舒张反应[6]。但是对宫内缺氧诱导心肌氧化应激及心肌损伤的持续时间及是否存在性别差异未见报道。本研究建立孕期宫内缺氧模型，研究其子代大鼠不同发育阶段心肌内损伤及氧化应激损伤情况，进而探讨宫内缺氧对心肌的影响及其可能机制。对开展改善缺氧对胎儿的心肌损伤的治疗措施具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 主要试剂MDA、 SOD 活力、GSH-Px活性等的检测试剂盒购买于南京建成生物技术有限公司。

1.2 实验动物实验用动物为 SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠(2月龄，体重170～230g，雌雄各24只)，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于福建省泉州医学高等专科学校实验动物中心。动物实验过程均遵循《实验动物管理条例》和《福建省实验动物管理条例实施细则》等相关规定进行。

1.3 模型建立及分组大鼠适应性喂养一周后，将雌性与雄性按1∶1的比例置于笼中交配，次日清晨如检查出阴栓者则判定为成功受孕，记录为妊娠第1d(Gestation Day，GD1)。妊娠大鼠(n=20)分为常氧组(n=8)和缺氧组(n=12)，被关在一个单独的笼子里，于通风良好，环境温度18℃～20℃，相对湿度50%～60%的环境内，在12h光照/12h黑暗循环下，定期更换垫料。参照Williams[7]和王振华等[8]实验方法建立宫内缺氧模型：将孕鼠于妊娠第4d置入低压缺氧箱内(氧气浓度：10%±0.1%)，维持4h，移出后随机取4只孕鼠麻醉后抽取动脉血行血气分析检查，判断造模成功与否。在妊娠第4d至妊娠第21d期间，每天上、下午各一次缺氧处理，每次4h。常氧组孕鼠于同期置于氧含量正常、等体积饲养舱中饲养。所有孕鼠给予正常饮食，分笼待产，自然分娩。取子代雌鼠为实验对象继续饲养，出生体重(Body weights，BW)低于对照组平均体重超过2个标准差为胎儿宫内发育迟缓幼崽则将纳入IH(Intrauterine Hypoxia，IH)组(30只)，后期进一步分为产后5d(新生儿，IH1)、产后20d(幼年期，IH2)和产后40d(青春期，IH3)[9]三个亚组；常氧组孕鼠子代纳入对照组(Control，Con)，分别Con1、Con2、Con3三个亚组。

1.4 样本制备子代大鼠饲养至产后5d、产后20d和产后40d，分别留取标本。实验动物在标本采集前禁食12h，测量体重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(1mL/kg)麻醉，迅速取出心脏，称重并记录，计算心脏质量指数[(心重mg/体重g)×103]。

1.5 心肌氧化应激相关指标检测用心脏组织制成10%匀浆液，经离心10min(3000r/min)后，取上清液进一步按照试剂盒说明进行检测：采用TBA比色法测定MDA，WST-1法测定总SOD活性，比色法测定GSH-Px。

1.6 统计学方法应用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料均数以(χ-±s)表示，组间比较采用t检验及方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组母体缺氧后生化指标的比较表1为孕鼠第1次缺氧处理4h后的动脉血气分析结果显示，结果显示：缺氧组血Pa02、Sa02较常氧组明显下降，差异具有统计学意义；血PaCO2、pH值差异无统计学意义(P＞0.05)。可见，该模型导致大鼠出现低氧血症，但没有酸中毒及二氧化碳潴留，适用于单纯缺氧因素的研究。

表1 孕鼠血气分析结果(n=4)

2.2 宫内慢性缺氧对体重及心脏指数的影响如表2所示，与常氧组相比，缺氧组在产后第5d的平均体重降低27%(对照组12.6±0.6 vs 缺氧组9.2±1.0，P＜0.05)(P＜0.05)，于产后第20d，两组体重无显著差别(P＞0.05)，提示子代鼠出现“追赶生长”现象。两组心脏重量无显著性差异，但缺氧组心脏重量指数(心脏与体重比，HW：BW)增大，差异有统计学意义。缺氧组大鼠心脏指数明显高于常氧组大鼠(P＜0.05)，显示 缺氧导致心脏肥大。

表2 缺氧组及常氧组子代大鼠体重(g)及心脏重量：体重比值(g/g)

2.3 宫内慢性缺氧致子代大鼠心肌内氧化应激损伤与常氧组相比，缺氧组心脏组织呈氧化应激状态，MDA 增加(图1A)，而抗氧化应激能力指标总SOD(图1B)和GSH-Px(图1C)活力明显降低(P＜0.05)。如图1所示，各缺氧组心肌MDA含量分别较常氧组增加了16.8%、15.1%、13.9%；各缺氧组心肌SOD活力明显降低，产后5d时下降约20.5%，产后20d时下降约23.4%，产后40d时下降约23.4%。各缺氧组GSH-Px活力分别较常氧组降低了23.5%、21.9%、23.3%。MDA、SOD、GSH-Px活力等缺氧组组与常氧组比较，差异均有统计学意义，MDA、SOD、GSH-Px活力等在各缺氧组间差异无统计学意义(均P＞0.05)。

图1 各组心肌组织氧化应激指标检测。图1A：心脏组织MDA(malondialdehyde)含量；图1B：心脏组织SOD(superoxide dismutase)活力；图1C：心脏组织GSH-Px(Glutathione peroxidase)活性，与常氧组相比，**P＜0.01。

3 讨 论

孕期缺氧导致胎儿宫内生长受限，本研究以宫内生长受限子代大鼠为研究对象，选取三个时间点分别为出生后5d、20d、40d为研究时间点，分别代表新生期、幼年期和青春期。研究发现，子代大鼠胎儿期受母体缺氧影响，出现生长受限，体重减低一直持续至幼儿期，但是在青春期时出现“生长追赶现象”，出生后40d的时候，缺氧组体重与常氧组无明显差异。这与Wang等[10]的研究结果是一致的。

胎儿起源假说认为宫内环境的质量与我们的基因组成相互作用，以增加晚年患病的风险。许多研究还证实了胎源性疾病的发生在性别上存在差异[11-13]。有研究证明宫内缺血缺氧诱导的大鼠后代认知能力下降在青春期是性别依赖性的，并且可以在成年大鼠中恢复。Verschuren等[14]研究发现宫内缺氧以性别依赖的方式改变了肾血管功能，雌性的血管功能显示出比雄性更强的收缩、舒张反应性。da Silva等[15]研究发现宫内缺氧导致雄性后代主动脉中的SOD和GSH-Px活性降低，同时增加血管对去甲肾上腺素的血管收缩剂反应，降低对血管扩张剂(乙酰胆碱)的舒张反应。相关研究还表明，雌性不论是在“追赶性”生长还是在行为学实验，乃至中枢AngⅡ受体的表达方面都未发现存在性别相关的差异。本实验表明孕期缺氧可导致子代雌性大鼠心肌氧化应激损伤，证实了宫内慢性缺氧对氧化应激方面的影响不存在性别差异。

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态。本实验通过检测MDA、SOD、GSH-Px反映氧化应激状态。ROS可氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸，形成脂质过氧化物，进一步造成功能蛋白损伤、RNA合成受阻，从而引起细胞衰老和凋亡。物进一步代谢产生MDA，因此，MDA水平可间接反映细胞损伤。SOD、GSH-Px是ROS重要的清除剂，共同将ROS浓度控制在较低的稳态水平[16-17]。胎儿心脏和脉管系统中的氧化应激是产前缺氧在以后心血管功能障碍发病机制的基础[18]。Giussani等[19]研究发现用维生素C干预可改善氧化应激损伤宫内缺氧孕鼠子代胎儿期、成年雄性大鼠的主动脉功能及氧化应激状态，也确认了氧化应激是宫内缺氧雄性大鼠的血管功能障碍发生发展中的重要地位。本研究显示不同发育阶段的雌性大鼠心肌MDA增加，提示心肌遭受氧化损伤；各缺氧组SOD、GSH-Px活性降低显示宫内缺氧降低了后代心肌内的抗氧化能力，以上数据与Giussani等的研究结果是一致的。

本实验针对经历慢性宫内缺氧的子代雌性大鼠在不同发育阶段的心肌损伤情况及其机制进行探讨，这些数据为预防高危妊娠后代心脏功能障碍的发育起源的机制和可能的干预靶点提供了参考。