一株对根癌农杆菌具有拮抗作用的成团泛菌的分离

李文?竺芊惠?胡勇?宋帅杰?胡霞?张宇鋆?邱琳凌?王天康?蒋欣童

摘要：成团泛菌（Pantoea vagans）是一种革兰氏阴性细菌，该菌广泛地存在于自然界中。本研究在进行樱花根癌病致病菌的生防细菌筛选中，分离得到了一株对樱花根癌病菌ACCC19197具有显著拮抗作用的菌株，将其命名为LWB35。通过抑菌圈试验，发现菌的平均抑菌圈可以达到2.1 cm。综合形态学、生理生化指标的结果，初步明确该菌属于泛菌。利用PCR扩增细菌的16S rRNA序列发现，该菌与成团泛菌高度同源，进一步鉴定该菌为成团泛菌。该菌株的成功分离，为樱花根癌病的生物防治提供了新的材料，也拓宽了我们对成团泛菌的认识。

关键词：成团泛菌;樱花根癌病;根癌农杆菌;生物防治

1.引言

成团泛菌作为泛菌属的模式菌，广泛存在于环境中。该菌可作为内生菌、腐生菌、病原菌及拮抗菌存在[1]。一些作为内生菌的菌株，可以在植物内部产生植物生长素，促进植物的生长。一部分菌株还可以通过抑制其他真菌或者细菌的生长，来预防因这些细菌引起的果实采后腐烂[2]。作为一种植物致病菌，它可以侵染多种植物，在国内外均有报道，包括水稻、玉米和核桃等[3-5]。对于成团泛菌在生物防治中的作用，也有相关报道。研究表明，成团泛菌产生的几丁质酶对水稻病害有明显的拮抗作用，对由细菌引起的火疫病也有较好的防治效果[6，7]。但是对于成团泛菌对根癌农杆菌的拮抗作用尚未有相关报道。

根癌农杆菌是一种土壤中广泛存在的革兰氏阴性细菌，该菌寄主范围广，能侵染大多数双子叶植物，造成植物的根部产生瘤状突起，严重时影响植物的生长，导致植株死亡。对于根癌病的防治，因其是根部病害，往往在病害已经很严重的时候才会得到养护人员的注意，因此，该病害的早期预防至关重要。生物防治就是这样一种防治方法，能够将病害控制在侵染前，通过拮抗菌的拮抗作用，对致病菌株进行防治，也是一种环保、高效的方法。对于根癌农杆菌生防菌的研究，澳大利亚科学家Kerr分离的K84是目前生产上应用较广的菌株，该菌能够产生核苷酸类细菌素，对根癌病的防治效果明显[8]。

基于以上现状，本研究希望能够从土壤中分离得到对樱花根癌病有较好防效的拮抗菌，以填补国内生防菌种类的不足。通过相关试验，课题组成员从土壤中分离得到一株对樱花致病根癌农杆菌有着显著拮抗作用的细菌，经形态学、生理生化及分子生物学手段分析，该菌为成团泛菌。研究结果为根癌病防治的微生物菌源提供了新的资源。

2.材料与方法

2.1 拮抗菌的分离及筛选

拮抗菌的分离及筛选主要采用梯度稀释和抑菌圈试验两种方法来进行，通过观察拮抗菌接种后产生的抑菌圈，来进行拮抗菌的筛选。

2.2 拮抗菌的鉴定

形态学方面，利用透射电镜进行拍照观察，生理生化指标参考《常见细菌系统鉴定手册》，分子生物学鉴定利用细菌的通用16S rRNA引物F8/R1492进行PCR扩增，扩增结果在NCBI数据库中进行比对分析。

3.结果与分析

3.1 拮抗菌的分离

为了分离得到对樱花致病根癌农杆菌At2有拮抗作用的细菌，我们从土壤中进行了土壤细菌的分离。通过抑菌圈试验，从2657株细菌中，分离获得了一株对At2有显著拮抗作用的细菌，该菌的抑菌圈平均直径在共培养2天后达到了2.1 cm，将该菌命名为LWB35（图1a）

3.2 拮抗菌的鉴定

为了鉴定拮抗菌的种类，我们通过三个层面进行综合分析。在形态学方面，菌株LWB35在YEB培养基上产生圆形、光滑的菌落。革兰氏染色为阴性。利用透射电镜观察，该菌为杆状，具有周生鞭毛（图1b）。该菌氧化酶阴性、接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可利用麦芽糖、蔗糖和木糖。根据该菌菌落特征和生理生化特点，初步判断该菌为泛菌。PCR扩增细菌16S rRNA序列后分析发现，该菌与Pantoea vagans亲缘关系最近。结合三种分析方法，将该菌归为成团泛菌。

4.讨论

成团泛菌作为一种植物致病菌，目前已有多篇相关报道。王大会等人从烟草细菌性叶枯病病叶中分离出了一株成团泛菌菌株，该菌能够引起烟叶中下部叶片腐烂，严重时病株率高达100%，对烟草的产量影响很大[9]。而作为一种拮抗菌，成团泛菌对水稻引起的病害和火疫病有着较好的防效[6，7]。本研究从土壤中分离筛选出一株对樱花根癌农杆菌有明显拮抗作用的成团泛菌，是之前尚未报道的。本研究结果扩宽了成团泛菌拮抗作用的范围，进一步明确了成团泛菌与根癌农杆菌之间的互作。但是，该菌是如何对根癌农杆菌进行拮抗作用的，他们的互作机理是什么，还需要进行试验来分析。

参考文献：

[1] Brenner， Don J， Krieg， et al. Bergeys Manual? of Systematic Bacteriology[M]. Springer US， 2005.

[2] Trifi H， Salem I B， Benzina N K， et al. Effectiveness of the Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Pantoea sp. BRM17 in Enhancing Brassica napus Growth in Phosphogypsum-Amended Soil[J]. Pedosphere， 2017.

[3] 洪永聪，胡方平，黄晓南. 成团泛菌（Pantoea agglomerans）对稻谷的致病性[J]. 福建农林大学学报（自然科学版），2002（1）：32-36.

[4] 曹慧英. 玉米新病害—细菌干茎腐病的研究[D]. 北京：中国农业科学院，2010.

[5] 李君，韩颖，赵宁，等. 云南31 个核桃品种对黑斑病的抗病性评价[J]. 中国植保导刊，2020，40（1）：67-71.

[6] Mukhopadhyay K， Garrison NK， Hinton DM， et al. Identification and characterization of bacterial endophytes of rice[J]. Mycopathologia， 1996， 134（3）：151-159.

[7] Pusey PL. Laboratory and field trials with selected microorganisms as biocontrol agents for fire blight[J]. VIII International Workshop on Fire Blight， 1999， 489（489）：655-662.

[8] Kerra A. Biological control of crown gall through production of Agrocin 84. Plant Disease，1980， 64（1）， 25-30.

[9]王大会，蒋承耿，王忠宇，等. 一种烟草细菌性叶枯病病原鉴定及防治藥剂筛选[J].中国烟草科学，2021，42（3）：65-70.

致谢

本研究由宁波市自然科学基金项目（2018A610215）、浙江省2021年度高校国内访问工程师“校企合作项目”（FG2021275）、2021年浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划宁波城市职业技术学院项目（2021R462001）和浙江省教育厅科研项目资助（Y202044834）共同资助。