大动脉炎患者中白细胞免疫球蛋白样受体A3多态性及蛋白表达

韩云霞，温晓婷，武泽文，李 红，张 斌，张莉芸

(1 山西医科大学第三医院，山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院风湿免疫科，太原 030032；2 山西白求恩医院，山西医学科学院，同济山西医院检验科；*通讯作者,E-mail:1315710223@qq.com)

大动脉炎(takayasu arteritis，TAK)是一种累及主动脉及其分支的血管炎症性疾病，表现为血管狭窄和闭塞导致相应部位缺血，也可表现为动脉扩张或动脉瘤的形成。该病首次是在日本的女性中发现，好发于40岁以下育龄期女性。TAK的病因及发病机制涉及多个方面，已有研究证明多个基因位点参与TAK的发病，如HLA-B 52*01。白细胞免疫球蛋白样受体A3(leucocyte immunoglobulin-like receptor A3,LILRA3)是LILRs的家族成员之一，LILRs主要表达在单核细胞，编码基因定位于人类19号染色体上(19q13.4)。根据其跨膜和胞质结构域结构，分为抑制性(LILRB1-5)、激活性(LILRA1，2，4，5)和可溶性受体(LILRA3)。LILRA3没有跨膜区，是唯一一种分泌型的可溶性蛋白[1-4]；LILRA3的另一个独特特性是存在6.7 kb缺失，6.7 kb的缺失是失去了7个外显子中的前6个，导致该基因免疫球蛋白样结构域丢失，从而影响其蛋白表达[5]。在一项基于日本人群的大样本研究中，共选择了633例TAK患者和5 928例健康者作为研究对象，通过全基因组关联分析(genome wide association study，GWAS)发现LILRA3基因上的SNP位点rs103294是TAK的易感基因，T是风险等位基因[6]，rs103294位于19号染色体上(19q13.4)，且rs103294是LILRA3的标签SNP(tagSNP)[7]，tagSNP是该区域的代表性SNP，T等位基因代表LILRA3 6.7 kb基因片段的缺失，C等位基因代表该基因片段存在[8]，根据两条染色体该基因片段的缺失分布不同，分为3种基因型：无缺失型(CC)、杂合子缺失型(CT)和纯合子缺失型(TT)。迄今为止，LILRA3的确切作用和功能尚不清楚，但能够与HLA Ⅰ类分子结合调节先天和适应性免疫[6]，LILRA3与干燥综合征、类风湿关节炎和成人Still等多种自身免疫疾病及炎症性肠病发病有关[9-12]。目前，关于LILRA3在TAK中的研究不多，在国外的研究中，仅有1篇对日本人群的研究，提出rs103294与TAK的临床特征(血管损伤)无关[13]；国内尚无有关LILRA3基因上SNP位点rs103294基因多态性、蛋白在TAK中的表达及其与血管分型和单核细胞的相关性方面的研究。本研究旨在探讨LILRA3基因上SNP位点rs103294的基因多态性及其蛋白在大动脉炎患者中的表达情况，LILRA3基因型与TAK血管分型的相关性，LILRA3蛋白表达量与单核细胞的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集山西白求恩医院2015年1月到2020年1月确诊的TAK患者52例，选取79例在山西白求恩医院健康体检并排除其他免疫疾病的就诊者作为健康对照组，检测LILRA3基因rs103294的基因多态性；52例TAK患者(TAK组)和36例健康对照者(健康对照组)检测了LILRA3蛋白表达。实验分为TAK组和健康对照组，抽取所有研究对象的静脉血2 ml，EDTA抗凝，离心后将血浆与细胞分装，-80 ℃保存。因3例TAK患者未做CT血管造影和血管超声检查，本研究中血管分型的研究对象为49例TAK患者。本研究得到山西白求恩医院伦理委员会的批准，批准号为YXLL-2021-047。

1.2 TAK患者入选标准

诊断符合美国风湿病协会(ACR)1990年分类标准：①发病年龄<40岁：出现症状或体征时年龄<40岁；②肱动脉搏动减弱：一侧或双侧肱动脉搏动减弱；③锁骨下动脉或主动脉杂音：一侧或双侧锁骨下动脉或腹主动脉闻及杂音；④肢体间歇性运动障碍：活动时1个或更多肢体出现乏力、不适或症状加重，尤以上肢明显；⑤血压差>10 mmHg：双侧上肢收缩压压差>10 mmHg；⑥动脉造影异常：主动脉一级分支或上下肢近端的大动脉狭窄或闭塞，病变常为局灶或节段性。6项中符合3项可诊断为大动脉炎。

1.3 排除标准

①先天性主动脉狭窄；②动脉粥样硬化；③纤维性结构不良；④血栓闭塞性脉管炎；⑤胸廓出口综合征。

1.4 主要试剂及仪器

试剂：Taq Plus DNA聚合酶(货号：B600090，中国生工)、10X PCR Buffer(含Mg2+)(货号：B600017，中国生工)、dNTP(10 mmol/L)(货号：B500056，中国生工)、引物DNA(中国生工)、6X DNA Loading Dye(货号：R0611，ThermoFisher)、DNA Ladder Mix(100-10000bp)(货号：SM0331，ThermoFisher)、DNA Ladder Mix(100～3000bp)(货号：B500347，中国生工)、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(货号：B518131，中国生工)、1X TE(货号：B548106，中国生工)、BigDye Terminator v1.1(货号：4336701，ThermoFisher)、POP-7TMPolymer(货号：4363785，ThermoFisher)、HiDi Formamide(货号：4311320，ThermoFisher)、Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒(货号：B518253，中国生工)、ELISA Kit(货号：abx152200，英国abbexa)。

仪器：PCR仪(美国ABI)、测序仪(美国ABI)、电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶成像仪(上海复日科技有限公司)、酶标仪(中国深圳雷杜生命科学有限公司)。

1.5 DNA提取

按照Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]说明书步骤提取全基因组DNA。

1.6 LILRA3基因rs103294基因型检测

用Primer Premier 5.0软件设计LILRA3基因的引物序列，F：5′-CTCCATGGATCACCCTGCAA-3′，R：5′-TGGCACAGAGGGTCAGGTCC-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s(每循环一次降低0.5 ℃)，72 ℃延伸20 s，循环10次；再次重复上述步骤，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次，72 ℃修复延伸10 min。取5 μl PCR产物，在含有1%琼脂糖凝胶中电泳，选择100 ～3 000 bp DNA Marker处理，电泳参数：150 V，100 mA，10 ～20 min电泳观察。通过ABI3730XL测序仪对PCR产物进行测序，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。通过测序仪检测两组样本的PCR产物，得到两组样本的基因序列，rs103294基因型为CC、CT和TT，等位基因为C、T。

1.7 ELISA检测外周血LILRA3蛋白表达量检测

用ELISA法检测LILRA3蛋白的表达量。取患者外周血，离心后取上清。每孔加100 μl标准品和样本；37 ℃孵育1 h；每孔加100 μl Detection Reagent A工作液，37 ℃孵育1 h；洗板3次；每孔加100 μl Detection Reagent B工作液，37 ℃孵育1 h；洗板5次；每孔加90 μl TMB，37 ℃避光孵育15 min；每孔加50 μl终止液；通过RT-6100酶标分析仪对样本分析并测定浓度。

1.8 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。LILRA3 rs103294基因型和等位基因频率采用基因计数法进行描述，组间比较、基因型及TAK血管分型采用χ2检验和Fisher确切概率法；LILRA3蛋白表达量采用中位数(四分位数间距)进行描述，各组间的差异比较用多样本秩和检验分析；两组LILRA3蛋白表达量与单核细胞之间使用秩相关进行相关性分析。

2 结果

2.1 TAK患者和健康对照临床资料的比较

TAK患者和健康对照组临床特征相比，两组性别和年龄差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05，见表1)。TAK患者ESR为(32.15 ±24.13)mm/h，CRP为(16.78 ±25.06)mg/L。与健康对照组相比，TAK组单核细胞数升高(P<0.05)。TAK血管分型在国内多采用Lupi-Herrera的4型方法，分别为头臂动脉型、胸腹动脉型、广泛型和肺动脉型，在本实验中头臂动脉型21例、胸腹动脉型2例、广泛型23例和肺动脉型3例，有3例患者未做CT血管造影检查和血管超声的检查，无法判断患者受累的血管分型，因此未纳入统计。

表1 TAK组和健康对照组临床特征的比较Table 1 Clinical characteristics of TAK patients and healthy controls

2.2 LILRA3的基因分型与电泳图

收集TAK患者和健康对照者外周血提取DNA，进行测序。测序结果表明LILRA3基因SNP位点上rs103294的基因型分为CC型、CT型和TT型(见图1)；通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小，rs103294的大小在432 bp(见图2)。

箭头强调在灰色背景的位置该基因发生改变，基因的改变造成这个位点的多态性图1 LILRA3基因上SNP位点rs103294不同基因型的基因序列Table 1 Sequences of different genotypes of SNP of rs103294 in LILRA3 gene

1.Marker;2-5.分别为TAK组CC、CT、TT、CC型；6-9.分别为健康对照组CC、CT、TT、CC型图2 不同基因型PCR产物的电泳鉴定Table 2 Electrophoretic identification of PCR products of different genotypes in TAK patients and healthy controls

2.3 TAK患者和健康对照rs103294基因型和等位基因频率比较

TAK组与健康对照组相比，LILRA3的TT与CT和CC基因型分布频率差异无统计学意义(χ2=0.43，P>0.05)。因CT和CC型的个体中LILRA3蛋白表达升高，因此将CT和CC型合并分析，结果显示，TT基因型与CT和CC基因型分布频率差异无统计学意义(χ2=0.12，P>0.05，见表2)。TAK组与健康对照组等位基因频率相比，差异无统计学意义(χ2=0.25，P>0.05，见表3)。

表2 TAK与健康对照组基因型的比较 例(%)Table 2 Comparison of genotype distribution between TAK patients and healthy controls cases(%)

表3 TAK组与健康对照组等位基因频率的比较 例(%)Table 3 Comparison of allele frequency between TAK patients and healthy controls cases(%)

2.4 TAK血管分型和基因型分布情况的比较

TAK组中各血管型以TT基因型为主；各血管型之间基因型分布差异无统计学意义(χ2=6.95，P>0.05，见表4)。

表4 TAK患者血管分型和基因型分布情况的相关性 例(%)Table 4 Correlation of vascular typing with genotype distribution in TAK patients cases(%)

2.5 TAK和健康对照外周血LILRA3蛋白表达量的比较

经正态检验后LILRA3的蛋白表达量为偏态分布，对两组外周血LILRA3蛋白表达量进行两样本秩和检验，结果显示TAK组和健康对照组LILRA3的蛋白表达量差异无统计学意义(Z=-1.07，P>0.05，见表5)。

表5 TAK组和健康对照组外周血LILRA3蛋白表达量的比较Table 5 Comparison of LILRA3 protein expression in peripheral blood between TAK group and healthy control group

2.6 各基因型与LILRA3蛋白表达量的比较

不同基因型中LILRA3蛋白表达量均为偏态分布，将样本总体的TT、CT和CC基因型的LILRA3蛋白表达量进行多样本秩和分析，结果显示TT、CT和CC组间LILRA3蛋白表达量差异无统计学意义(H=3.58，P>0.05，见表6)。

表6 不同基因型之间LILRA3蛋白表达量的比较Table 6 Comparison of LILRA3 protein expression level among TT, CT and CC genotypes

2.7 TAK组和健康对照组单核细胞数与LILRA3蛋白表达量之间相关性

TAK组和健康对照组单核细胞数和蛋白表达量均为偏态分布，采用秩相关进行相关性分析。结果显示，两组单核细胞数均与LILRA3蛋白表达量不相关(TAK组：r=0.04，P>0.05;健康对照组：r=0.21，P>0.05;见图3)。

图3 TAK和健康对照组LILRA3蛋白表达量与单核细胞数的相关性分析Figure 3 Correlation analysis between monocyte number and LILRA3 protein expression in TAK patients and healthy controls

3 讨论

大动脉炎在风湿免疫病中是一种罕见病，病变主要累及主动脉及其分支，在疾病发展过程中，会导致主动脉瘤、脑卒中和缺血性脑病等疾病，严重时危及生命。大动脉炎的发病机制涉及多个方面，其中遗传因素在发病过程中起着重要作用。GWAS研究提出LILRA3基因上的SNP位点rs103294是TAK的易感基因位点，T等位基因是影响疾病易感性的风险基因，因此本研究中探讨了TAK患者中LILRA3基因上SNP位点rs103294的多态性和蛋白表达，分析了LILRA3与血管分型和单核细胞数的相关性。LILR是近年来免疫球蛋白超家族新发现的一组同时参与天然免疫和适应性免疫的受体[14,15]。多种人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)在TAK患者中表达升高，促进TAK的疾病进展，已有研究证明LILRA3能与HLA Ⅰ类分子结合。HLA-B52是TAK患者的易感基因位点，已有研究证明TAK患者中存在HLA-B52+时，rs103294的TT基因型频率增加[6]，LILRA3可能在TAK中发挥着作用。研究证明LILRA3与多种自身免疫疾病相关，如干燥综合征、类风湿关节炎等疾病的发病有关[9,10]。在本研究中，虽然TT基因型、T等位基因比率有高于健康对照组的趋势，但TAK和健康对照TT基因型和T等位基因无差异。本研究结果表明，rs103294与中国汉族人群中的血管分型无关，研究结果与一项日本人群中的研究结果相符，Kadoba等[13]对日本人群TAK患者临床特征进行分析，提出rs103294与TAK的临床特征(血管损伤)无关。

LILRA3基因片段在部分个体中存在6.7 kb缺失，导致基因免疫球蛋白样结构域的丢失，蛋白表达降低。已有研究报道该基因缺失影响LILRA3蛋白水平，但在本研究中TT与CC基因型个体之间的蛋白表达量无差异。LILRA3主要表达在单核细胞上，虽然在TAK患者中单核细胞数升高，但本研究结果表明LILRA3的蛋白表达量与单核细胞数无关，可能是因为其他炎性细胞因子的影响。以往研究报道IL-10和TNF-γ可以上调LILRA3的蛋白表达，TNF-α下调LILRA3的蛋白表达[16]。TAK在疾病大发展过程中，有TNF-α、IL-9和IL-10等炎性细胞的参与[17-19]，推测外周血中LILRA3的蛋白表达可能受到细胞因子的影响。本研究另一个结果显示LILRA3蛋白表达量与CRP有相关性，但是否作为炎性指标来评价TAK还需进一步研究。

本研究存在着一些局限性。LILRA3基因缺失分布有着明显的地域差异，中国汉族人群中LILRA3基因的缺失比率为76%；在进一步研究该基因在汉族人口地域的分布时，发现从东北(80.6%)向南(47.4%)逐渐降低，呈现明显的地域差异[20]，而本研究中选择的人群为就诊于山西白求恩医院的患者，可能在选择的人群上存在抽样偏倚；rs103294通过大样本的GWAS研究确定是TAK的易感基因，rs103294是LILRA3的tagSNP，且有研究提出T等位基因代表LILRA3 6.7 kb基因片段的缺失，C等位基因代表该基因片段存在[8]。在本研究中TAK的TT基因型、T等位基因有高于健康对照组的趋势，这还需要大量的样本来证明这一观点，因TAK是一种罕见病，患病人数较少，且在正常人群中也有缺失，本研究可能是由于样本量较少，反映不出两组之间的差异，还需进一步扩大样本量。

综上所述，LILRA3蛋白表达量与临床特征无关；虽然TAK中LILRA3 SNP rs103294频率无明显升高，但rs103294的TT基因型和T等位基因频率有高于健康对照组的趋势，还需增大样本量进一步研究。