联合检测BRD4、SSBP1与PCDH17在胃癌早期诊断中的应用价值

殷晓霞，李 永，白 睿，刘 博，孙改霞

(1.河北北方学院附属第一医院病理科，河北 张家口 07500；2.河北北方学院附属第一医院医学影像科，河北 张家口 075000)

临床中，胃癌为较常见的恶性肿瘤，虽然手术联合放化疗有助于改善早期胃癌患者预后，但部分患者预后仍较差[1]。因此，探寻胃癌的发病机制，明确其早期诊疗靶标，对于胃癌临床诊疗意义重大。溴结构域蛋白4(bromodomain protein 4，BRD4)为溴结构域和超末端结构家族成员，有研究显示，BRD4参与肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖、转移、侵袭等过程[2]。线粒体单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding protein，SSBP1)是线粒体DNA合成的重要因子，其可对线粒体生物功能产生一定影响[3]。既往研究显示，SSBP1与肺腺癌、肝癌等肿瘤有关[4-5]。另有研究报道，肿瘤相关蛋白可对肿瘤细胞的生物学特征造成一定影响，致使肿瘤细胞的黏附能力发生变化[6]。原钙黏蛋白17( proto-cadherin 17，PCDH17)是一种钙依赖性跨膜蛋白，在多种肿瘤组织中表达异常[7]。因此，本研究探讨了BRD4、SSBP1、PCDH17与胃癌的关系，旨在为胃癌的早期诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月—2020年10月于我院接受手术切除、消化内镜黏膜下剥离术或胃镜活检的150例患者纳入研究，术前均未经放化疗治疗。其中，胃癌组织组(50例)：均经术后病理诊断为原发性胃癌，男性26例，女性24例；年龄31～73岁，平均(52.07±2.37)岁。癌前病变组织组(50例)：均经病理诊断为低级别或高级别上皮内瘤变，男性22例，女性28例；年龄33～74岁，平均(53.11±3.05)岁。正常胃黏膜组织组(50例)：均经病理诊断为非萎缩性胃炎，男性25例，女性25例；年龄30～72岁，平均(52.69±2.91)岁。3组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1组织样本中BRD4、SSBP1及PCDH17蛋白检测 将收集的组织标本用石蜡包埋，作连续切片(厚度4 mm左右)。应用免疫组织化学染色法测定组织标本中BRD4、SSBP1及PCDH17蛋白水平。石蜡切片经脱蜡、醇化后，应用柠檬酸钠缓冲液高温修复抗原，维持沸腾10 min后自然冷却，滴加10%正常山羊血清封闭(37 ℃ 20 min)，加入一抗(BRD4抗体，1∶1 000稀释，由Bethyl Laboratories公司提供；SSBP1抗体，1∶200稀释，由Abcam公司提供；PCDH17，1∶500稀释，由R&D Systems公司提供)，4 ℃过夜，次日加入对应二抗，恒温箱孵育(37 ℃ 30 min)，DAB显色，苏木精复染，中性树脂胶固；以磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照。

1.2.2相关血清指标检测 采集3组空腹静脉血8 mL，经离心处理(1 500 r/min，15 min)后分离血清。血清癌抗原199( carbohydrate antigen,CA199)应用电化学发光法检测，全自动电化学发光免疫分析仪购自罗氏公司，型号为E602；血清胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)Ⅰ、PGⅡ、胃泌素17(gastrin-17,G-17)应用酶联免疫吸附测定双抗体夹心法检测，试剂盒购自上海江莱生物科技公司；血清幽门螺杆菌(helicobacter pylori，HP)抗体应用胶体金法定性检测，试剂盒购自珠海市银科医学工程公司。

1.3结果评价 由本院经验丰富的病理科医师进行双盲法分析，在400倍光学显微镜下，选取10个高倍视野(每个视野100个细胞)，计算BRD4、SSBP1与PCDH17阳性细胞占同类细胞的比例。阴性(0分)：阳性细胞≤5% ，弱阳性(1分)：阳性细胞为5%～30%，中等阳性(2分)：阳性细胞为30%～60%，强阳性(3分)：阳性细胞>60% 。评分为1～3分均判定为阳性。BRD4阳性染色判断标准：胞浆及细胞核内呈现棕黄色或棕褐色颗粒。SSBP1阳性染色判断标准：细胞质内呈现棕黄色或棕褐色颗粒。PCDH17阳性染色判断标准：细胞质内呈现黄色、棕黄色或褐色颗粒。

1.4统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件数据分析。计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验；等级资料比较用秩和检验；应用ROC曲线分析BRD4、SSBP1及PCDH17诊断早期胃癌的价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1组织样本中BRD4、SSBP1及PCDH17的表达 胃癌组织中BRD4和SSBP1呈高表达，而PCDH17呈低表达。3组组织样本中BRD4、SSBP1及PCDH17的阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 组织样本中BRD4、SSBP1及PCDH17的表达STable 1 Expression of BRD4, SSBP1 and PCDH17 in tissue samples (n=50，例数)

2.2 3组血清指标分析 3组血清CA199、PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及HP阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)；胃癌组织组患者血清CA199、PGⅠ、G-17水平及HP阳性率明显高于癌前病变组织和正常胃黏膜组织组，而PGⅡ水平低于癌前病变组织和正常胃黏膜组织组(P<0.05)，见表2。

表2 3组血清指标分析Table 1 Analysis of serum indicators in three groups

2.3BRD4、SSBP1及PCDH17的表达与胃癌临床特征的关系 不同性别、年龄、肿瘤直径及分化程度的胃癌组织中BRD4、SSBP1、PCDH17的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)；临床分期为Ⅲ期～Ⅳ期、发生淋巴结转移的胃癌组织中BRD4、SSBP1、PCDH17的阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 BRD4、SSBP1及PCDH17的表达与胃癌临床特征的关系Table 3 Relationship between BRD4, SSBP1 and PCDH17 expression and clinical features of gastric cancer (n=50,例数，%)

表3 (续)

2.4ROC曲线分析 由ROC曲线分析可知，BRD4诊断胃癌的AUC为0.806(95%CI:0.811～0.913,P<0.05),诊断敏感度为85.62%，特异度为82.49%%；SSBP1诊断胃癌的AUC为0.759(95%CI:0.745～0.883,P<0.05),诊断敏感度为81.77%，特异度为76.83%；PCDH17诊断胃癌的AUC为0.703(95%CI:0.694～0.823,P<0.05),诊断敏感度为78.49%，特异度为72.62%；BRD4+SSBP1+PCDH17诊断胃癌的AUC为0.895(95%CI:0.867～0.998,P<0.05),诊断敏感度为89.46%，特异度为86.31%；结果提示，与单一指标比较，BRD4+SSBP1+PCDH17诊断的敏感度和特异度均较高，见图1。

图1 ROC曲线分析Figure 1 ROS curve analysis

3 讨 论

胃癌为临床常见的恶性肿瘤，尽管治疗方式不断改善，但患者预后仍不理想[8]。因此，探究胃癌发病机制，明确其早期诊疗靶标，对于胃癌的临床诊治意义重大。BRD4为BET家族成员之一，其与肿瘤的发生进展有关[9]。张华鹏[10]研究报道，BRD4在肝癌细胞中呈高表达,且其表达量随疾病进展而升高，敲低BRD4可抑制肝癌细胞增殖。吴小秦等[11]学者研究报道，BRD4在喉鳞状细胞癌肿瘤组织中呈高表达，可促进癌细胞转移。SSBP1为一种同源四聚体，可参与线粒体DNA的复制、转录[12]。杨丹平等[13]学者提出，SSBP1在食管鳞状细胞癌组织中表达上调，参与食管鳞癌的发生进展。PCDH17为一种单链跨膜蛋白，可介导细胞间黏附作用[14]。最近有文献报道，PCDH17在多种肿瘤组织中呈低表达，其参与肿瘤的发生进展[15]。由以上研究可知，BRD4、SSBP1及PCDH17与恶性肿瘤有关，因此，本研究进一步探究了三者联合诊断胃癌的临床价值。

本研究显示，3组组织样本中BRD4、SSBP1及PCDH17的阳性率比较差异有统计学意义，胃癌组织中BRD4和SSBP1呈高表达，而PCDH17呈低表达。结果提示，BRD4和SSBP1可能对胃癌的发生起促进作用，PCDH17可能是潜在的抑癌基因。张竹等[16]学者研究发现，BRD4和SSBP1在早期胃癌组织中的阳性表达率较高，与胃癌前病变进展有关。朱春霞等[17]学者研究发现，PCDH17基因甲基化诊断胃癌的特异度较高，可用于胃癌早期筛查。本研究探究了胃癌与患者临床特征的关系，发现临床分期为Ⅲ期～Ⅳ期、发生淋巴结转移的胃癌组织中BRD4、SSBP1、PCDH17的阳性率比较差异有统计学意义。结果提示，BRD4、SSBP1、PCDH17的表达与胃癌临床分期、淋巴结转移有关。究其原因可能为：①BRD4可能通过调控信号通路促进胃癌进展[18]；②SSBP1突变可诱导肿瘤组织中mtDNA的突变，当该突变积累到某种程度时，可引起肿瘤病变[19]；③PCDH17表达下调对组织的浸润能力造成一定影响，还可对淋巴结黏附分子的运动造成一定影响，进而促使疾病进展[20]。本研究进一步采用ROC曲线分析发现，BRD4+SSBP1+PCDH17联合诊断的敏感度和特异度均高于单一指标。结果提示，BRD4、SSBP1与PCDH17可作为胃癌早期诊断标志物。

本研究显示，3组血清CA199、PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及HP阳性率比较差异有统计学意义；胃癌组织组患者血清CA199、PGⅠ、G-17水平及HP阳性率明显高于癌前病变组织和正常胃黏膜组织组，而PGⅡ水平低于癌前病变组织和正常胃黏膜组织组。CA199为糖类抗原，其是结直肠癌、胃癌等消化系统肿瘤标志物[21]。PG为胃黏膜分泌的产物，其在临床胃癌的筛查中具有一定价值[22]。G-17可反映胃窦分泌功能，其在胃癌诊断和筛查中发挥重要作用[23]。HP是诱发胃癌的主要病原体，HP的毒力因子(CagA和VacA等)可促进胃癌的发生[24]。因此，检测相关血清指标有利于临床胃癌的辅助诊断。

综上所述，联合检测BRD4、SSBP1与PCDH17，辅以相关血清指标，有利于临床胃癌的鉴别诊断。