茶皂素对蛞蝓体内酶活性的影响

付 莉

(贵州省核桃研究所，贵州 贵阳 550005)

0 引言

【研究意义】蛞蝓(AgriolimaxagrestisLinnaeus)属软体动物门腹足纲柄眼目蛞蝓科，俗称鼻涕虫，其分布广泛，发生较普遍，可危害多种农作物[1]。目前，蛞蝓的防治主要以喷洒四聚乙醛等化学农药为主，长期使用极易使蛞蝓产生抗药性，影响防治效果。茶皂素(Tea saponin)又称茶皂苷或茶皂甙，是从山茶科植物种子或种子经榨油后的产物中提取的一种糖甙化合物，属于五环三萜类，广泛存在于各种茶类植物中[2]。茶皂素不仅具有溶血、鱼毒、消炎和类似植物激素等活性，而且是一种优良的农药制备助剂，可直接作为生物农药用于防治有害生物[3-4]。弄清茶皂素对蛞蝓体内酶活性的影响，对蛞蝓的生物防治具有重要意义。【前人研究进展】潘如军等[5]研究表明，茶皂素对甘薯小象甲(Cylasformicarius)有明显的取食忌避作用和强烈的拒食作用，且茶皂素能使甘薯小象甲幼体发育历期缩短，甚至能导致幼体死亡。曾驰等[6]研究表明，30%茶皂素水剂对茶小绿叶蝉(Empoascapirisuga)具有良好的防治效果。王小艺等[7]研究发现，茶皂素对菜青虫(PierisrapaeL.)3～5龄幼虫均有强烈的拒食作用。王志高等[8]研究表明，40 mg/L和 50 mg/L茶皂素处理48 h对室内福寿螺的防治效果达100%。【研究切入点】茶皂素作为一种良好的植物源农药对多种害虫防效显著，还可作为杀螺和杀鱼的清塘剂，但未见茶皂素对蛞蝓体内酶活性影响的研究报道。【拟解决关键问题】探明茶皂素对蛞蝓保护酶和解毒酶活性的影响，以期为蛞蝓的生物防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源 蛞蝓600头，2021年5月中旬采自贵州省长顺县白菜地，带回实验室用遮光培养箱饲养，每天饲喂新鲜小白菜，挑选大小一致的蛞蝓进行后续试验。按文献[9]的方法鉴定，其为双线嗜黏液蛞蝓(Phiolomycusbilineatus)，伸展时体长35～37 mm，体宽6～7 mm，体灰白色，腹足底部肉白色，体背部中央和两侧各有1条黑褐色纵线，生殖孔位于右后触觉的后侧方。

1.1.2 药剂与试剂盒 83%茶皂素可湿性粉剂，购自杭州中野天然植物科技有限公司；超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器 OCE-Y30型组织研磨器，天根生化科技有限公司；TU-1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；MX-F型漩涡振荡器，南京东迈科技仪器有限公司；Thermo-17R型高速冷冻离心机，南京以马内利仪器设备有限公司；W202B型恒温水浴锅，上海申胜生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒力测定 试验于2021年5月在贵州省林业科学院实验室进行。茶皂素设5个浓度处理，以等量清水为对照(CK)，共计6个处理。5个浓度茶皂素处理分别为20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL和1.25 mg/mL。采用浸液法将蛞蝓放入CK和各浓度处理的药液中浸3 s，取出后直接放入培养皿中，每皿中接入大小一致的蛞蝓10头，每天放入新鲜白菜叶，3次重复，将放入蛞蝓的培养皿进行遮光处理，统计72 h蛞蝓死亡数，采用SPSS 26.0得出毒力方程。

1.2.2 试虫处理 根据毒力测定结果，以72 h的LC20作为亚致死浓度，处理健康、大小一致的蛞蝓，处理时间设6 h(处理1)、12 h(处理2)、24 h(处理3)、48 h(处理4)和72 h(处理5)5个处理, 均以等量清水相同处理时间为对照(CK)。处理完成后取健壮、活泼的幼虫，冰箱中-80℃保存，用于酶活性测定。

1.2.3 酶活性测定 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、乙酰胆碱酯酶(AchE)酶液的制备及活性测定方法参照各试剂盒说明，采用分光光度法测定。

1.3 数据处理

采用SPSS 26.0对数据进行统计分析，处理间差异采用单因素方差分析，用LSD方法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 茶皂素对蛞蝓的毒力

试验结果表明，茶皂素对蛞蝓的毒力方程为y=2.949x-2.934，R为0.975；亚致死浓度(LC20)为5.123 mg/mL，95%置信区间为2.722～7.355；致死中浓度(LC50)为9.883 mg/mL，95%置信区间为6.805～14.480，说明茶皂素对蛞蝓具有较高的浸杀活性。

2.2 茶皂素不同时间处理蛞蝓保护酶的活性

从表1看出，茶皂素亚致死浓度(LC20)不同时间处理蛞蝓幼虫体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等保护酶活性具有激活和抑制作用。SOD：不同时间处理及同期CK分别为1.31～2.43 U/mg和2.97～3.35 U/mg，不同时间处理酶活性均低于CK，各处理较CK降低18.46%～56.04%，除处理4与CK间差异显著外，其余时间处理与CK间差异极显著，表明不同时间处理对SOD活性均具有抑制作用。POD：不同时间处理及同期CK分别为3.87～4.58 U/mg和3.82～5.36 U/mg，除处理1与CK间差异极显著外，其余时间处理与CK间差异均不显著；其中，处理2和处理4较CK分别升高1.33%和8.12%，处理1、处理3和处理5较CK分别降低27.80%、4.09%和13.79%，表明处理2和处理4对POD活性具有激活作用，处理1、处理3和处理5对POD活性具有抑制作用。CAT：不同时间处理及同期CK分别为15.99～28.33 U/mg和20.28～27.28 U/mg，各处理与CK间均差异极显著，处理1和处理2较CK分别升高29.66%和9.80%；处理3、处理4和处理5较CK分别降低12.18%、41.39%和30.70%，表明处理1和处理2对CAT活性具有激活作用，处理3～5对CAT活性具有抑制作用。

表1 茶皂素亚致死浓度(LC20)不同时间处理蛞蝓保护酶的活性

2.3 茶皂素不同时间处理蛞蝓解毒酶的活性

从表2可知，茶皂素亚致死浓度(LC20)不同时间处理蛞蝓幼虫体内羧酸酯酶(CarE)、乙酰胆碱酯酶(AchE)和谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)等解毒酶活性均具有抑制作用。CarE：不同时间处理及同期CK分别为4.57～5.97 U/mg和5.45～6.16 U/mg，各处理较CK降低3.08%～23.06%，除处理2和处理4与CK间差异极显著外，其余处理与CK间差异均不显著。AchE：不同时间处理及同期CK分别为0.44～0.58 U/mg和0.59～0.65 U/mg，各处理较CK降低6.45%～31.25%，各处理与CK间差异极显著。GSTs：不同时间处理及同期CK分别为39.00～56.74 U/mg和51.06～65.61 U/mg，各处理较CK降低13.52%～29.43%，各处理与CK间差异极显著。

表2 茶皂素亚致死浓度(LC20)不同时间处理蛞蝓解毒酶的活性

3 讨论

超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶统称为保护酶系统[10]，在3种酶的共同作用下，细胞内的自由基维持在一个较低水平，从而防止自由基毒害。吴德东等[11]报道，舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫经北乌头乙酸乙酯萃取物亚致死浓度(LC20)处理后，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性均为先激活后抑制。何发林等[12]研究表明，溴氰虫酰胺亚致死剂量初期可诱导小地老虎(Agrotisipsilon)体内过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性升高。研究结果表明，茶皂素亚致死浓度(LC20)对蛞蝓体内SOD活性表现为抑制作用，对POD活性表现为抑制-激活-抑制-激活-抑制作用，对CAT活性表现为先激活后抑制作用。

羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S-转移酶在分解外源毒物、维持正常生理代谢方面起着重要作用[13]。张振威等[14]研究发现，舞毒蛾2龄幼虫体内AchE活性在甲维盐的作用下均明显受到抑制，处理 24 h 后GSTs 活性被激活。白桂芬等[15]研究表明，多菌灵对蚯蚓(Earthworm)体内的乙酰胆碱酯酶整体具有抑制作用，对谷胱甘肽S-转移酶整体具有激活作用，对羧酸酯酶活性在低浓度时具有诱导激活作用，高浓度时具有抑制作用。张文领等[16]报道，福寿螺螺(Pomaceacanaliculata)在四聚乙醛亚致死浓度胁迫下，乙酰胆碱酯酶活性在福寿螺鳃和腹足内呈先升后降趋势，肝脏和肠内活性呈先降后升趋势。鳃、肠和腹足内GSTs活性均呈先降后升再降趋势。研究结果表明，茶皂素亚致死浓度(LC20)处理后，蛞蝓体内羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性均不同程度受到抑制，且谷胱甘肽S-转移酶随处理时间延长，其抑制作用增大。

4 结论

茶皂素对蛞蝓具有较高的浸杀活性，72 h的亚致死浓度(LC20)为5.123 mg/mL，可有效干扰蛞蝓体内SOD、POD、CAT、CarE、AchE和GSTs的活性，扰乱其正常生理代谢功能。