微量硫对铁锰合金的生物相容性及降解的影响

冯靖雯，徐文利，陈军修，谭丽丽，杨泽

（1.中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院正畸科，辽宁省口腔疾病重点实验室，沈阳 110002；2.中国科学院金属研究所师昌绪先进材料创新中心，沈阳 110016；3.常州大学材料科学与工程学院，江苏 常州 213164）

研究［1-2］显示，铁基合金具有优异的机械性能和良好的生物相容性，在具有可降解性的心血管支架中具有良好的应用前景。有研究［3］表明心血管可降解铁基支架材料中铁锰（Fe-Mn）合金的力学性能和顺磁性相当于316L不锈钢。另外，研究显示Fe-Mn合金浸泡7 d后分解速度高于纯铁且低于镁合金［4］；Fe-Mn合金浸泡15 d后的降解速度与纯铁相同，为0.23～0.24 mm/年［5］。为了进一步加快Fe-Mn合金的降解速度，MORAVEJ等［6-7］研究显示，将纯铁制成超微晶粒薄膜进行降解实验，纯铁超微晶粒的降解速度为0.40 mm/年，显著高于纯铁的降解速度（0.14 mm/年）。2010年SCHINHAMMER等［8］提出了可以改变铁基降解速度的设想：（1）将活性金属加入铁内，使铁基合金的降解速度加快；（2）铁中添加惰性金属元素，在合金内部形成弥散分布的微小金属化合物，此化合物与基体形成电偶腐蚀。SCHINHAMMER等根据设想（2）制做了Fe-Mn-Pd系列合金，合金中分布着富含Pd的FePd和MnPd化合物，研究结果显示，与碳钢比较，合金极化电阻降低，降解速度加快。也有研究［9］表明，加入非金属（碳）显著加快了Fe-Mn合金（Fe-30Mn-1C）的降解速度。目前，关于硫（S）对Fe-Mn合金降解的影响研究鲜有报道。本研究探讨微量S对Fe-Mn合金的生物形容性和降解的影响。

1 材料与方法

1.1 合金制备

纯铁、纯锰和S购于沈阳博宇有色金属炉料有限公司。合金冶炼在中国科学院金属研究所完成。合金制作过程：使用1 kg真空感应炉，分别制作成分为Fe-30Mn-0.05S（wt.%）和Fe-30Mn的铁基合金。然后利用中国科学院金属研究所锻造机在1 050 ℃下持续锻造1 h，锻造后放在空气中进行冷却，最终获得直径25 mm的圆棒。将圆棒放在1 100 ℃的电阻炉中加热30 min后迅速取出放到室温水中冷却，然后吹干备用。利用X射线衍射仪（X-ray powder diffractometer，XRD；D/MAX-RB，日本理学公司）对合金的成分进行观察和分析。利用线切割将合金切成10 mm×10 mm×2 mm的圆片进行后续的实验。

1.2 电化学测试

电化学测试在V3（型号为Princeton Applied Research Versa STAT3）电化学工作站进行。采用标准三电极体系，样品为工作电极，铂片作为辅助电极，饱和甘汞作为参比电极。将样品用环氧树脂固定，样品的一端面连接铜线，另一端面露在外面，其面积为1 cm2，并将露在外面的端面精细抛光。在开路电位-时间测试中，测试样品直到开路电位稳定为止。在测试中，先后测量开路电位，然后在开路电位下进行Electrochemical Impedance Spectroscopy（EIS）测试，电化学测试中使用的溶液为生理盐水溶液，pH7.4，温度37 ℃，样品面积和溶液体积为1 ∶350（cm2/ mL）。

1.3 体外浸泡实验检测样品的降解速度

样品打磨后经过清洗、吹干后称重。然后将样品浸入生理盐水中，37 ℃恒温保存。为了使酸碱度稳定，前10 d换液频率为1次/2 d，然后换液频率为1次/5 d。14 d后取出样品，经无水乙醇清洗、吹干后利用XRD观察和分析。样品的降解速度计算公式［10］：

其中，CR为降解速度（mm/年），W为样品质量减重（g），A为样品在溶液中面积（cm2），t为样品在溶液中的时间（h），ρ为样品密度（g/cm3）。利用德国Dataphysics 接触角测量仪 TBU 95 测量样品表面能，计算采用OWRK几何平均法。

1.4 溶血率检测

溶血率检测按ISO10993-12：2007（E）及YY/T0127.1-93标准执行。取新鲜兔耳静脉抗凝血（1 mL），与0.9% PBS溶液按照4 ∶5比例混合。将Fe-30Mn合金和 Fe-30Mn-0.05S合金样品按比例（表面积∶溶液体积为 1.25 ∶1 cm2/mL）置于PBS溶液中，37 ℃恒温箱中培养30 min，然后加入稀释兔血（兔血∶溶液为1 ∶50）继续恒温箱中培养1 h。培养结束后取出样品，3 000 r/min离心5 min，取上清液用DR6000 分光光度计（美国哈希HACH公司）在540 nm 波长检测其吸光度。每种样品测试3次，计算其平均值。溶血率计算公式［11］：

其中，Dt为合金样品的吸光度值，Dnc为阴性对照组（PBS液）吸光度值，Dpc为阳性对照组（水）吸光度值。阳性对照组吸光度值应为0.8±0.3，阴性对照组吸光度值应≤0.03。参考标准：参考值>5%，样品有溶血作用；参考值≤5%，样品可以植入［12］。

1.5 血小板黏附能力检测

Fe-30Mn合金和Fe-30Mn-0.05S合金样品清洗后干燥，然后放在孔板上进行紫外线消毒。采集健康志愿者静脉血，使用20 g/L草酸钾作抗凝剂，血液和抗凝剂比例为20 ∶1。，将抗凝血1 500 r/min离心15 min后取上清液，得到新鲜富血小板血浆。将2种样品浸泡于富血小板血浆中，37 ℃恒温箱中分别培养0.5 h、3 h，然后吸去富血小板血浆并立即加入PBS溶液静置10 min，再吸走PBS，漂洗2～3次后加入2.5 %戊二醛溶液，放入4 ℃冰箱固定12 h。Fe-30Mn合金和Fe-30Mn-0.05S合金样品乙醇梯度脱水和脱醇，经干燥和喷金处理后，Apreo 2扫描电子显微镜（中国赛默飞世尔科技有限公司）观察合金样品表面血小板的黏附数量和形态。

2 结果

2.1 2种合金成分分析

结果显示，合金经固溶处理后，Fe-30Mn合金显示为单一的奥氏体相，而Fe-30Mn-0.05S合金中除了奥氏体相外，还存在ε、α马氏体。Mn是奥氏体稳定元素，扩大奥氏体区域，α区缩小。在Fe-30Mn合金中只存在γ相，而加入少量S后，合金中检测到少量的α相和ε相，S扩大了铁素体区域，表明它是铁素体稳定化元素，且可以促进ε碳化物的形成。碳化物及α相的形成将对合金的耐蚀性能产生重要影响。见图1 。

图1 2种合金XRD图谱

2.2 2种合金降解性能分析

Bode图和相位角图与合金的降解性能密切相关，Bode图反映阻抗与频率的关系，在低频下，阻抗值越大，合金的耐蚀性能越好［13］。如图2 所示，合金在0.9%NaCl溶液中的阻抗谱曲线，在0.01 Hz下，Fe-30Mn合金的阻抗值为210 Ω·cm2，Fe-30Mn-0.05S合金的阻抗值为144 Ω·cm2，表明Fe-30Mn-0.05S合金的降解速度快于Fe-30Mn合金。相位角图反映相位角与频率的关系，通过相位角峰值个数可判断合金的时间常数，进而判断合金的腐蚀机制是否相同。结果显示，2种合金均具有1个峰值，相应有1个时间常数。2种合金的腐蚀机制相似［14］。从阻抗谱的相位角曲线上可看出，合金被腐蚀后样品表面的粗糙度会增加，耐蚀性能越差，表面粗糙度越大，因而也可表明Fe-30Mn合金的降解速度慢于Fe-30Mn-0.05S合金。体外浸泡实验是研究合金耐蚀性能最有效、最直观的方法。2种合金在0.9%NaCl溶液中的单位面积失重和降解速度见图3。结果显示，Fe-30Mn-0.05S合金的失重随着浸泡时间增加呈现线性增加，且在不同时间点其损失的质量均显著大于Fe-30Mn合金。Fe-30Mn合金和Fe-30Mn-0.05S合金在0.9%NaCl溶液中的降解速度分别约为0.10 mm/年和0.14 mm/年，可见加入微量S使Fe-30Mn合金的降解速率提升了40%。

图2 2种合金样品在0.9%NaCl溶液中的阻抗谱曲线

图3 2种合金样品在0.9%NaCl溶液中的失重和腐蚀速度

2.3 2种合金表面能分析

结果显示，Fe-30Mn的极性分量（γsd）、色散分量（γsp）、γsp/γsd分别为43.85 dyn/cm、29.33 dyn/cm、66.89%；Fe-30Mn-0.05S的γsd、γsp、γsp/γsd分别为43.47 dyn/cm、32.90 dyn/cm、75.7%。2种合金γsp/γsd均较高，说明2种合金均拥有良好抗血小板黏附性能。见图4。

图4 2种合金XRD图谱

2.4 2种合金溶血率及血小板黏附性能

结果显示，Fe-30Mn合金、Fe-30Mn-0.05S合金的溶血率分别为2.04%、2.11%，Fe-30Mn-0.05S合金略高于Fe-30Mn合金。2种合金的溶血率均<5%，表明都符合植入标准。

血小板黏附性能检测结果显示，Fe-30Mn合金、Fe-30Mn-0.05S合金与血小板接触 30 min 后表面上附着少量血小板，血小板处于静息状态，未观察到伪足；接触180 min后，样品表面均未见有血小板黏附，见图5。

图5 2种合金样品血小板黏附情况 ×500

3 讨论

3.1 S对Fe-Mn合金降解性能的影响

研究表明，在铁中加入锰可以加快腐蚀速度。HERMAWAN等［15］研究Fe-Mn合金发现，合金的降解形貌相近，其降解速率为520 mm/年，约为纯铁的2倍。研究［16］显示，S作为铁合金的杂质，会加速铁合金的腐蚀。主要原理包括：（1）S与铁和锰化合形成FeS和MnS化合物，由于这些化合物电极电位比铁基体高，因而其与铁容易形成原电池，铁基体作为阳极，化合物作为阴极加速铁合金的腐蚀速度；（2）S加入使原本具有单一奥氏体相的合金中出现了铁素体相，两相之间存在电位差，在腐蚀性介质中易于形成原电池，从而加快Fe-Mn合金的腐蚀速度。本研究结果显示，Fe-30Mn-0.05S合金降解速度比Fe-30Mn合金更快，与以往研究结果一致。

3.2 S对Fe-Mn合金血液相容性的影响

结果显示，Fe-30Mn合金、Fe-30Mn-0.05S合金的溶血率分别为2.04%、2.11%，Fe-30Mn-0.05S合金略高于Fe-30Mn合金。2种合金的溶血率均<5%，表明2种合金都符合植入标准，满足医用植入材料对溶血性能的要求。同时，2种合金溶血率与降解速度一致，这可能是因为较高的降解速度使周围溶液环境pH 值升高，较高的降解速度导致了相对较高的溶血率。

2种合金血小板黏附检测结果显示，与血小板接触30 min、180 min后均未出现血小板黏附，说明2种合金都具有良好的抗血小板黏附能力。

综上所述，Fe-30Mn-0.05S合金显示出良好的降解性能和血液相容性，在可降解心血管支架方面具有良好的应用前景。本研究仅探讨了Fe-30Mn-0.05S合金的降解性能和血液相容性，合金的生物学性能（细胞毒性、成骨性能等）研究还需要深入开展，合金的体内降解及代谢机制还需要进一步明确。