FFAR4、HDGF在胆管癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

周奇，王卫东

(南京医科大学附属无锡市人民医院介入科，江苏 无锡 214002)

胆管癌是恶性程度、死亡率均较高的恶性肿瘤，来源于胆管体系上皮细胞。随着现阶段医疗技术水平的不断提高，胆管癌临床发现率也在逐年增加，在消化系统检出恶性肿瘤中增长最快，居胆道恶性肿瘤第二位，占消化系统恶性肿瘤3%[1]。然而，因胆管癌解剖特殊性，再加上肿瘤恶性程度高，早期缺乏特殊临床症状及特异性检查手段，疾病起病较为隐匿，早期诊断较为困难，不少胆管癌患者检出肿瘤时已出现局部浸润或远处转移[2]。现阶段，生物治疗已成为胆管癌最具前景的治疗策略之一，寻找有效的治疗靶点将直接决定生物治疗前景[3]。游离脂肪酸(free fatty acids，FFAS)是机体重要代谢物质，通过CD36等转运体进入细胞，进而参与多种生理过程。游离脂肪酸受体4 (free fatty acid receptor 4，FFAR4)即FFAS激活的膜受体之一，又被称为G蛋白偶联受体120，属于G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCR)，GPCR表达失调与癌症发生发展密切相关[4]。肝癌衍生生长因子(hepatoma-derived growth factor，HDGF)是来源于人原发性肝癌细胞系的肝素结合蛋白，在多种胚胎组织中高表达，参与调控肾、肺、肝、消化道、心血管等组织器官的生长发育，在多种恶性肿瘤中呈高表达。本研究分析胆管癌癌组织中FFAR4、HDGF的表达水平，从临床病理特征及生存情况层面进行综合分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2020年1月南京医科大学附属无锡市人民医院80例具有完整生存资料的胆管癌患者胆管癌组织(离肿瘤边缘向内至少1 cm)作为研究对象，均为术前未通过化放疗或其它特殊治疗的胆管癌组织标本。所有患者中，男性47例，女性33例；年龄41～78岁，平均(61.54±7.93)岁；肿瘤部位：肝门43例，中下段37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期37例；病理分化程度：高分化27例，中分化24例，低分化29例。另外取40例行胆管癌根治性手术患者的癌旁胆管组织作为对照组(距肿瘤边缘>3 cm的癌旁胆管组织)，经病理确认为正常组织。纳入标准：(1)符合肝门部胆管癌规范化诊治专家共识诊断标准[5]，经病理活检证实为原发性胆管癌，于南京医科大学附属无锡市人民医院初治；(2)年龄≥18岁；(3)术前未接受过放化疗以及其他生物治疗；(4)无其他肿瘤病史。排除标准：(1)合并自身免疫或血液疾病；(2)合并重要脏器功能障碍；(3)合并其他恶性肿瘤；(4)临床资料不完整。

1.2 资料收集

收集患者基础临床资料，调查员均经统一规范培训，经考核合格后担任，对漏填、错填情况立即补充完成，确保原始资料有效性。一般情况包括性别、年龄等；疾病资料包括肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、临床分期、神经侵犯及淋巴结转移情况等。

1.3 仪器与试剂

仪器：石蜡切片机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，S700A)、恒温水浴箱(上海恒奇仪器仪表有限公司，TX150)、电热恒温干燥箱(上海沪升实验仪器，H/HWHS-100L)、光学显微镜(日本奥林巴斯，BX-50)；试剂：FFAR4兔抗人多克隆抗体、HDGF兔抗人多克隆抗体(美国Immuno Way公司)，SP试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司)，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)缓冲液、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)、柠檬酸缓冲液均由北京中杉金桥生物技术公司提供。

1.4 方法

取患者组织标本，4 μm厚切片，烘烤(60 ℃、20 min)，使用二甲苯脱蜡处理，并使用梯度酒精脱水，PBS清洗(3次)，去离子水冲洗，室温下，H2O2阻断(10 min)，PBS清洗(3次)，抗原热修复，再次PBS清洗(3次)。置切片于10%的牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)下，孵育(室温、5 min)，封闭非特异性位点，加入一抗， 孵育(4 ℃、过夜)，PBS清洗(3次)。滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的链霉亲和素(streptavidin，SP)，孵育(37 ℃、30 min)，PBS清洗(3次)，DAB显色(10 min)，PBS清洗(3次)，苏木素复染，盐酸酒精分化，脱水(10 min)，进行封片，镜下观察。

由两位病理科医师光学显微镜下独立阅片分析，确定染色与蛋白表达情况，阅片者阅片和分析前均不了解研究对象临床资料，判定结果意见存在分歧时经协商达成一致结论。高倍镜下随机选取5个视野，注意保证每一视野可观察细胞数≥200个，FFAR4主要定位于肿瘤组织细胞质中，HDGF主要定位于肿瘤组织细胞核中，依据阳性细胞染色强度和比例评估[6]：着色：无、淡黄、棕黄、棕褐分别计0分、1分、2分、3分；阳性细胞比例：阴性、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分别计0分、1分、2分、3分、4分；参照着色程度与阳性细胞比例乘积进行分级，<6分为低表达，≥6分为高表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料通过[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验；通过Kaplain-Maier方法描绘生存曲线，计算生存率，并用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FFAR4、HDGF蛋白在胆管癌组织中的表达

胆管癌组织FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表达率分别为65.00%、83.75%，高于癌旁组织的17.50%、27.50%(P<0.05)。见表1及图1。

表1 FFAR4、HDGF蛋白在胆管癌组织中的表达[n(%)]

2.2 胆管癌组织中FFAR4、HDGF蛋白表达与临床病理特征参数的关系

不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、神经侵犯情况胆管癌组织中FFAR4、HDGF蛋白表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；低分化、临床分期Ⅲ-Ⅳ期、发生淋巴结转移患者胆管癌组织中FFAR4、HDGF蛋白表达水平高于中高分化、临床分期Ⅰ-Ⅱ期、未发生淋巴结转移患者(P<0.05)。见表2。

表2 胆管癌组织中FFAR4、HDGF蛋白表达与临床病理特征参数的关系

2.3 影响胆管癌组织FFAR4、HDGF蛋白表达的Logistic回归分析

将上述因素差异有统计学意义项纳入多因素Logistic回归模型，以FFAR4、HDGF蛋白情况作为因变量，FFAR4蛋白(低表达=0，高表达=1)，HDGF蛋白(低表达=0，高表达=1)，以上述差异有统计学意义项作为自变量，并进行赋值，分化程度(中高分化=0，低分化=1)、临床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴结转移(阴性=0，阳性=1)，Logisitic回归分析显示临床分期高、分化程度低、发生淋巴结转移是FFAR4、HDGF蛋白高表达的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响胆管癌组织FFAR4、HDGF蛋白表达的Logistic回归分析

2.4 胆管癌癌组织中FFAR4、HDGF蛋白表达与预后的关系分析

随访两年，根据随访情况，绘制两年无进展生存曲线和总生存曲线，FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表达患者两年总生存率分别为50.00%(26/52)、55.22%(37/67)，低于FFAR4蛋白、HDGF蛋白低表达患者的78.57%(22/28)、84.62%(11/13)(P<0.05)。FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表达患者两年无进展生存率分别为42.31%(22/52)、47.76%(32/67)，低于FFAR4蛋白、HDGF蛋白低表达患者71.73%(20/28)、76.92%(10/13)(P<0.05)。见图2-图5。

3 讨论

胆管癌临床治疗以手术切除为主，但由于疾病临床症状与体征出现较晚，缺乏特征性，早期诊断较为困难，疾病确诊往往已达中晚期，预后较差，深入探讨胆管癌发生及发展机制，寻找治疗新靶点，对预防胆管癌术后复发转移具有重要价值[7～8]。

FFAR4属于GPCR超家族中视紫红质受体家族，激活后可通过Gq/11磷脂酰肌醇、Gα/ 环腺苷酸信号通路调控激素分泌以及细胞分化；此外，FFAR4通过β抑制蛋白2激活信号通路，抑制炎症激活[9]。Cui等[10]发现，人结直肠癌中FFAR4的表达显著高于癌旁组织，并与肿瘤进展相关。本研究也显示胆管癌组织中FFAR4蛋白表达水平高于癌旁组织，这可能是由于FFAR4高表达刺激IκBα第32位丝氨酸磷酸化，诱导PI3K/ AKT-NF-KB通路，增加血管内皮生长因子、白介素-8、前列腺素E2等的分泌，促进胆管癌组织血管生成[11]。本研究还显示，FFAR4蛋白表达与胆管癌患者临床分期、组织分化、淋巴结转移有关，提示FFAR4可能参与了胆管癌发生发展过程，究其原因可能为：胆管癌组织FFAR4异常高表达会促进癌细胞生长，触发一系列胞内信号改变，最终促进癌细胞增殖，诱发血管生成及转移等恶性细胞生物学行为[12]。本研究中FFAR4高低表达患者2年总生存率、2年无进展生存率低于FFAR4低表达患者，提示FFAR4表达可作为评估胆管癌患者预后的指标。

细胞生物学相关研究[13]表明，HDGF是肝素结合生长因子，生物学功能广泛，如有丝分裂活性、血管生成等。HDGF过表达状态下，通过结合体内血管生成活性，诱导血管内皮细胞生长因子，形成肿瘤。本研究中胆管癌组织细胞较癌旁组织HDGF明显呈现高表达，可能是因为：一方面HDGF是促进细胞有丝分裂的有效因子，可促进多种组织细胞增殖分化；另一方面肿瘤细胞增殖依靠丰富血供，HDGF能促进肿瘤增殖及血管生长，参与肿瘤微血管形成；此外，HDGF过表达降低Fas表达活性，促进细胞恶性转化，抑制细胞凋亡。体外研究报道[14]指出干扰或中和HDGF可显著抑制肿瘤细胞恶性生物学行为。本研究分析胆管癌组织中HDGF蛋白表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移病理特征相关，推测HDGF促进肿瘤增殖和转移。在胆管癌发展过程中，各种生长因子参与细胞增殖、分裂过程，HDGF高表达可激活细胞外信号调节激酶途径，促使血管内皮生长因子分泌上调、微血管密度增加，进而促进肿瘤血管生成，加速肿瘤生长，并为其血行转移提供条件[15]。同时本研究还发现HDGF高表达胆管癌患者，两年无进展生存率和总生存率较低，预后较差，这些结果提示HDGF高表达可作为判断胆管癌不良预后的标志物之一，对患者预后评估具有一定指导价值。本研究分析了胆管癌组织FFAR4、HDGF表达与临床病理及预后的关系，但并未通过体外研究明确在 FFAR4、HDGF基因敲低情况下人源性胆管癌细胞增殖、杀伤及迁移能力变化，后续尚需对FFAR4、HDGF在胆管癌发生发展中的作用和作用机制作进一步研究。

综上，胆管癌组织FFAR4、HDGF呈现高表达，且其高表达水平与肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移相关，预示患者不良预后，二者在肿瘤的发生和发展中发挥关键作用，因此，干扰FFAR4、HDGF表达可能是一个胆管癌治疗靶点之一。