汽化过氧化氢对生物安全实验室工作台面的消毒效果

戴陈伟，刁慧敏，江杨帆，吕涵，周秀红

(安徽省医学科学研究院，安徽 合肥 230061)

生物安全实验室是指通过一系列的防护屏障和管理措施，以避免或控制被操作的有害生物因子危害，从而达到生物安全要求，使得实验室可以用于开展微生物学、生物化学、生物医学、动物实验等领域的研究[1]。生物安全实验室目前在科研、卫生等领域使用非常广泛，为了保证实验室的安全运行，减少潜在风险，保证实验结果的准确无误以及保护实验人员的人身安全，对生物安全实验室工作台面进行有效消毒是一项非常重要的措施[2]。一方面，实验室工作人员需要接触感染性病原体，这很容易引起实验室感染事件[3]；另一方面，病原微生物实验室的实验操作，如样品混合、吸吹、离心和转移、开瓶(管)帽等很难避免气溶胶的生成，可能污染操作环境，从而导致测试样品之间的交叉污染，影响测试结果的可靠性[4-5]。

生物安全实验室的消毒尤其是工作台面的消毒，对于生物安全实验室的良好运行以及工作人员的保护起到非常重要的作用。帖金凤等[6]使用英国Bioquell 消毒机，按12 mL/m3速率用35% 的过氧化氢对生物安全实验室进行汽化消毒，处理60 min后，放置在室内不同位置表面的菌片上的枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢可被100%杀灭。韩杰等[7]用汽化过氧化氢进行P3生物安全实验室模拟现场消毒试验，结果显示，当空气中过氧化氢浓度为1 800 mg/m3，汽化过氧化氢消毒装置运行60 min时，对各个位置载体上枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭对数值均大于6.0。

传统消毒剂如84消毒液、新洁尔灭等化学消毒剂对实验室工作台面的消毒效果较好，细菌杀灭率一般可超过95%[8-9]。但84消毒液、新洁尔灭消毒后一般都会产生残留，并且使用后实验室会有一定的刺激性气味，长期使用此类消毒方法还会使实验室常见菌产生耐性，降低消毒效果[10]。另外使用84消毒液、新洁尔灭对工作台面进行消毒时一般只会对正面及看得到的侧面进行消毒，导致工作台的下面及不容易消毒的位置就会留下消毒死角，从而影响整体消毒效果，带来安全隐患。

过氧化氢溶液化学性质活泼，易分解为氧气和水，无残留毒性，因而过氧化氢消毒不会对环境造成二次污染，被称为最清洁的消毒剂。除了作为一种强氧化剂被广泛应用于生物化学领域[11]，过氧化氢超强的氧化能力也可以破坏微生物体内的原生质，从而达到杀灭微生物的效果，其对细菌繁殖体、真菌和细菌芽孢均有很好的杀灭作用[12-13]。过氧化氢消毒的原理主要是过氧化氢分子及其分解后产生的游离羟基和活性衍生物可直接作用和破坏细菌细胞膜，使其内容物外泄，导致细菌机体死亡，或与微生物的蛋白质和核酸发生反应，导致其结构破坏和死亡[14]。

汽化过氧化氢发生器是一种新型的实验室消毒设备，按照规定的消毒程序将液态过氧化氢汽化，完成实验室消毒。汽化过氧化氢发生器采用食品级过氧化氢，消毒过程自动化，所以对工作人员无毒无害，不会对实验室工作台和实验仪器造成损害，同时对实验室工作台面消毒彻底、不留死角[6]。汽化过氧化氢适用于空间消毒，除生物安全实验室外，还可用于医院病房、实验动物中心、优良制造标准车间及各种生物安全设备(如隔离器、传递窗、生物安全柜和高效过滤器等)的消毒，具有广阔的应用前景。随着各国出台的环保安全法规日趋严格，对于过氧化氢消毒的研究成为消毒领域的热门课题之一。

本研究首先对3%过氧化氢消毒液进行中和剂鉴定和悬液定量杀灭试验，并进一步使用汽化过氧化氢对生物安全实验室工作台面进行消毒，将对生物安全实验室工作台面的消毒效果同84消毒液和新洁尔灭进行比较，探讨三种消毒方法在实际使用中的优缺点，为生物安全实验室工作台面的日常消毒工作提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HTY-SUPER SD2型汽化过氧化氢发生器(浙江泰林生物技术股份有限公司)，SQ810C蒸汽高压灭菌器(江阴滨江医疗设备厂)，3002电子天平(杭州友恒称重设备有限公司)，Ⅱ级A型生物安全柜(江苏苏净集团有限公司)，SPX-150B-Z生化培养箱(上海博讯实业有限公司)。

1.2 材料

84消毒液(山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号200811)，新洁尔灭(山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号200402)，胰蛋白胨大豆琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司，批号20190930)，3%过氧化氢消毒液(山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号201118)。

2 试验方法

2.1 中和剂鉴定试验

按《消毒技术规范》卫生部2002年版[15]中和剂鉴定试验进行，选择金黄色葡萄球菌(ATCC6538)作为细菌繁殖体代表，白色念珠菌(ATCC10231)作为真菌代表进行中和剂鉴定试验，以含20 g/L硫代硫酸钠和10 g/L吐温80的PBS(phosphate buffered saline)溶液作为中和剂。试验分为6组，如表1所示。

表1 中和剂鉴定试验Table 1 Groups of neutralizer identification test

2.2 悬液定量杀灭试验

取适量3%过氧化氢消毒液于无菌大试管中，置于20 ℃水浴中备用。取无菌试管，加入0.5 mL有机干扰物和0.5 mL试验菌后，再吸取4 mL消毒剂迅速混匀。分别于作用5、10和15 min时，取试验菌与消毒剂混合液0.5 mL加入到4.5 mL的中和剂中，混匀，再作用10 min后，进行活菌计数培养，计算杀灭对数值。试验重复3次。

2.3 实验室消毒试验

2.3.1 消毒方法

汽化过氧化氢：尽量保持工作台所在实验室密闭，同时用封口胶带将实验室门缝密封，按照汽化过氧化氢发生器操作规程进行操作，以1 500 mg/m3的流量对实验室进行消毒，消毒时间60 min。

84消毒液：配制400 mg/L的84消毒液，使用高压灭菌处理的清洁布浸泡后对工作台进行消毒，消毒时间15 min。

新洁尔灭：配制0.1%的新洁尔灭消毒液，使用高压灭菌处理的清洁布浸泡后对工作台进行消毒，消毒时间15 min。

2.3.2 采样方法

消毒前采样：随机选择3个实验室的工作台面，各放置2个5 cm×5 cm大小的无菌规格板，将经高压灭菌处理过的无菌棉拭子在装有无菌生理盐水的试管内浸湿后，在规格板内采用螺旋式方法均匀涂抹3次。采样结束后用经高压灭菌处理过的剪刀剪除棉拭子与手接触的部分，将剩余棉拭子置于装有无菌生理盐水的试管中，充分混匀，待检。

消毒后采样：分别用汽化过氧化氢、84消毒液、新洁尔灭对3个工作台面进行消毒，消毒后的采样方法与消毒前保持一致，消毒后的采样位置应为消毒前同一工作台面附近的位置。

分别于消毒前60 min和消毒后30 min对工作台面同一部位采用相同取样方法取样，进行活菌培养计数。

3 试验结果

3.1 中和剂鉴定试验结果

如表2所示，第1组无菌落生长；第2组金黄色葡萄球菌菌落生长数平均值为3.4×103CFU/mL，白色念珠菌菌落生长数平均值为2.3×103CFU/mL；第3、4、5组菌落生长数明显多于第2组，其金黄色葡萄球菌菌落生长数组间误差率分别为3.06%、3.30%和3.70%，白色念珠菌菌落生长组间误差率分别为4.69%、3.38%和8.00%；第6组无菌落生长。结果表明，含20 g/L硫代硫酸钠和10 g/L吐温80的PBS溶液可以作为该过氧化氢消毒液杀灭金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的中和剂。

表2 中和剂鉴定试验结果Table 2 Results of neutralizer identification test 单位：CFU/mL

3.2 悬液定量杀灭试验结果

如表3所示，用过氧化氢消毒液对悬液内的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别作用10、20、30 min，重复3次，平均杀灭对数值均大于5.00；用过氧化氢消毒液对悬液内白色念珠菌分别作用10 、20、30 min，重复3次，平均杀灭对数值均大于4.00。悬液定量杀灭试验结果表明，过氧化氢消毒液对悬液内的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别作用10 min及以上，按《消毒技术规范》卫生部2002年版[15]悬液定量杀灭试验要求，均可以达到消毒合格。

表3 过氧化氢消毒液杀灭试验结果Table 3 Results of sterilization of hydrogen peroxide disinfectant

3.3 实验室消毒试验结果

表4 三种消毒方法消毒前后菌落数比较Table 4 Comparison of colonies number before and after disinfection with three disinfection

同时计算三种消毒方法的杀菌率，试验结果显示汽化过氧化氢组的细菌杀灭率最小值为92.9%、最大值为100%、平均值为(98.54±2.53)%，84消毒液组细菌杀灭率最小值为92.9%、最大值为100%、平均值为(96.65±3.09)%，新洁尔灭组消毒液细菌杀灭率最小值为89.5%、最大值为100%、平均值为(94.54±4.30)%，细菌杀灭率平均值按照从大到小排序为汽化过氧化氢组、84消毒液组、新洁尔灭组，且该差异有统计学意义(F=3.487，P=0.045<0.05)，详见表5。

表5 三种消毒方法杀菌率比较Table 5 Comparison of disinfection efficacy of three disinfection

4 结论

研究结果显示，含20 g/L硫代硫酸钠和10 g/L吐温80的PBS溶液可以作为本研究所使用的3%过氧化氢消毒液的中和剂，且该过氧化氢消毒液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作用10 min及以上，杀灭对数值大于5.00，对白色念珠菌作用10 min及以上，杀灭对数值大于4.00，均消毒合格。

汽化过氧化氢进行消毒后细菌杀灭率(98.54±2.53)%优于84消毒液和新洁尔灭的消毒效果。由于汽化过氧化氢发生器是通过将过氧化氢汽化实现其消毒功能，使用过氧化氢发生器进行消毒的实验室要求密闭效果较好[16]，而生物安全实验室一般密闭性都比较好，因此汽化过氧化氢可以作为一种很好的生物安全实验室工作台面消毒方法[17]。