来曲唑对高龄雌性SD大鼠子宫内膜容受性、血管内皮生长因子和内皮型一氧化氮合酶表达的影响Δ

刘 静，李 翠，于 倩

(1.唐山市妇幼保健院妇科，河北 唐山 063000； 2.唐山市妇幼保健院生殖遗传科，河北 唐山 063000)

随着社会的快速发展以及工作、生活压力的增大，晚婚晚育已成为一种社会趋势，但随着年龄的增加，女性的生育能力明显降低，不孕症已成为亟需解决的社会学问题[1]。据报道，排卵障碍导致的不孕在不孕症中所占比例为25%～30%[2]。尽管通过超促排卵可以让高龄不孕患者得到较高的排卵率，但容易对子宫内膜容受性产生不利影响，最终会导致不良妊娠结局[3-4]。因此，迫切需要开发新的治疗方法来改善高龄不孕患者的子宫内膜容受性。来曲唑为芳香化酶抑制剂，可以提高患有无排卵多囊卵巢综合征的低生育力女性的妊娠率[5]。但关于来曲唑对高龄超促排卵模型大鼠子宫内膜容受性的影响鲜有报道。因此，本研究通过构建高龄超促排卵模型大鼠，主要探讨来曲唑对高龄超促排卵模型大鼠子宫内膜容受性的影响以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

60只SPF级、32周龄雌性SD大鼠购自肇庆市瑞思元生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(粤)2020-0053。30只SPF级、32周龄雄性SD大鼠购自广州赛业百沐生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(粤)2020-0055。所有动物实验均遵循3R原则，该研究得到我院动物伦理委员会的批准。

1.2 仪器

CX33型光学显微镜(日本Olympus公司)；KYKY-2800B型扫描电镜(北京中科科仪股份有限公司)；ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(北京世纪科信科学仪器有限公司)。

1.3 药品与试剂

来曲唑片(批准文号：国药准字H19991001；批号：20201203)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)、尿促性腺激素(HMG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)均购自马鞍山丰原制药有限公司；逆转录试剂盒(货号：Qiagen 205111)购自上海玉博生物科技有限公司；HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit(货号：Q222-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；兔源一抗血管内皮生长因子(VEGF)(货号：ab32152)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS，货号：ab252439)均购自美国Abcam公司。

1.4 超促排卵模型构建及分组

当大鼠处于动情周期的第3日开始造模，在每日上午7:00通过腹腔注射GnRH-a 13.5 μg/kg，每日注射1次，连续9 d，第9日腹腔注射GnRH-a时还需按照50 IU/kg的剂量注射1次HMG，2 d后按照900 IU/kg的剂量腹腔注射1次HCG[6]。当观察到大鼠阴道分泌物明显增多，且通过显微镜可观察到分泌物中含有大量的无核角化细胞时，则为造模成功[7]。

将SD大鼠分为对照组、模型组、来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组及来曲唑高剂量组，每组12只。除对照组外，其他组均需构建超促排卵模型。建模成功后，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠分别按照0.13、0.26和0.52 mg/kg的剂量灌胃来曲唑[8]；对照组、模型组大鼠灌胃等体积的0.9%氯化钠溶液，从给药后第1日开始，每日18:00至次日8:00将雌性、雄性大鼠按照2∶1的比例合笼，合笼后通过阴道涂片观察雌性大鼠出现精虫的时间，精虫首次出现的时间记作妊娠第1日。在妊娠第6日时，麻醉大鼠后解剖腹腔，观察子宫中胚泡着床情况，记录大鼠胚胎着床率及平均着床胚泡数；收集子宫内膜组织，分为两部分，一部分固定于4%多聚甲醛中，另一部分冻存于液氮中保存。

1.5 苏木精-伊红染色(HE染色)检测大鼠子宫内膜病理变化

将固定在4%多聚甲醛中的子宫内膜组织经石蜡包埋后，用切片机切成5 μm厚的切片，经HE染色后，利用光学显微镜观察子宫内膜病理变化。

1.6 扫描电镜观察大鼠子宫内膜胞饮突表达

用PBS将子宫内膜冲洗干净，然后用2.5%戊二醛固定，经乙醇梯度脱水、叔丁醇干燥、冷冻10 min后，真空干燥2 h，将样本用EIKO IB-3喷金粒子镀膜仪喷金，利用扫描电镜观察大鼠子宫内膜胞饮突表达情况。

1.7 定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测子宫内膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA的表达

使用Trizol试剂提取组织中的总RNA，通过逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，利用HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit进行qRT-PCR反应。以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCT法计算VEGF mRNA、eNOS mRNA的相对表达水平，引物序列见表1。

表1 VEGF、eNOS和GAPDH的qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR of VEGF, eNOS and GAPDH

1.8 免疫组化分析大鼠子宫内膜中VEGF、eNOS的表达

将5 μm厚的石蜡切片常规脱蜡浸水，加入柠檬酸缓冲液，微波炉加热进行抗原修复。用PBS洗涤后，加入内源性过氧化物酶封闭液孵育10 min，用PBS洗涤后用山羊血清封闭20 min，然后除去血清封闭缓冲液，分别加入一抗VEGF(1∶200)、eNOS(1∶500)在4 ℃下反应过夜。次日，切片用二抗孵育10 min，与链霉亲和素-过氧化物酶溶液反应10 min，并用二氨基联苯胺染色进行显色。最后，将切片用苏木精复染并用中性树胶封片，利用光学显微镜观察，以细胞质呈现棕黄色颗粒为阳性表达。利用Image-Pro Plus 6.0分析系统分析阳性染色的光密度和面积，平均光密度值=阳性染色的光密度值/面积。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 五组大鼠胚胎着床率、平均着床胚泡数比较

与对照组比较，模型组大鼠胚胎着床率、平均着床胚泡数显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠胚胎着床率、平均着床胚泡数显著升高，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 五组大鼠胚胎着床率、平均着床胚泡数比较(n=12)Tab 2 Comparison of embryo implantation rate and average number of implanted blastocyst among five groups of rats(n=12)

2.2 五组大鼠子宫内膜病理变化比较

对照组大鼠子宫内膜增生，变厚，固有层水肿，血管增加且变粗；模型组大鼠子宫内膜发育缓慢，子宫内膜变薄，血管较少，细胞核固缩；与模型组比较，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠子宫内膜增生，变厚，固有层疏松水肿，血管数量增多，且来曲唑浓度越高，对应的变化趋势越明显，见图1。

A.对照组；B.模型组；C.来曲唑低剂量组；D.来曲唑中剂量组；E.来曲唑高剂量组A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group图1 大鼠子宫内膜病理变化(HE，×200)Fig 1 Pathological change in endometrium of rats (HE，×200)

2.3 五组大鼠子宫内膜胞饮突表达比较

对照组大鼠子宫内膜胞饮突大量表达，胞饮突的突起比较明显，界限清晰，有光滑的表面，微绒毛消失；模型组大鼠子宫内膜胞饮突较对照组显著减少，发育迟缓，体积、大小不一致，表面有大量微绒毛存在；与模型组比较，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠子宫内膜胞饮突表达增多，且来曲唑浓度越高，越接近于对照组，见图2。

A.对照组；B.模型组；C.来曲唑低剂量组；D.来曲唑中剂量组；E.来曲唑高剂量组A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group图2 大鼠子宫内膜胞饮突表达(扫描电镜)Fig 2 Expression of pinopode in endometrium of rats (scanning electron microscope)

2.4 五组大鼠子宫内膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表达水平比较

与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠子宫内膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表达水平显著升高，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 五组大鼠子宫内膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表达水平比较Tab 3 Comparison of VEGF mRNA and eNOS mRNA levels in endometrium among five groups of rats n=12)

2.5 五组大鼠子宫内膜中VEGF、eNOS表达比较

VEGF、eNOS阳性产物主要分布在细胞浆中。与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜中VEGF、eNOS平均光密度值显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠子宫内膜中VEGF、eNOS平均光密度值显著升高，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3—4和表4。

表4 五组大鼠子宫内膜中VEGF、eNOS平均光密度值比较Tab 4 Comparison o mean optical density values of VEGF and eNOS in endometrium among five groups of

A.对照组；B.模型组；C.来曲唑低剂量组；D.来曲唑中剂量组；E.来曲唑高剂量组A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group图3 大鼠子宫内膜中VEGF表达(免疫组化，×400)Fig 3 Expression of VEGF in endometrium of rats (immunohistochemistry, ×400)

3 讨论

近年来，晚育已成为我国的趋势，随着三孩政策的实施，希望怀孕的高龄女性(≥35岁)逐渐增多[9]。据相关报道，女性生育力约从35岁开始显著下降[10]。众所周知，高龄女性的生育能力下降与卵巢功能和卵母细胞质量下降有关[11]。然而，关于高龄女性生育能力下降是否与子宫内膜容受性有关的研究却很少。子宫内膜容受性指子宫内膜为胚胎定位、黏附、浸润和着床提供最佳环境的一系列生理变化[12]。据报道，子宫内膜容受性在妊娠中起着重要作用，被诊断为存在生育障碍的高龄女性，其生育障碍与子宫内膜容受性降低有关[13]。良好的子宫内膜容受性对于胚胎着床至关重要，超促排卵可对子宫内膜容受性产生不利影响，最终造成排卵率高、妊娠率低的不良结局[14]。本研究利用GnRH-a+HMG+HCG构建超促排卵大鼠模型，通过HE染色发现，对照组大鼠子宫内膜增生，固有层水肿，血管增加且变粗；模型组大鼠子宫内膜发育缓慢，子宫内膜变薄，血管较少，细胞核固缩，提示模型组大鼠子宫内膜发育滞后且存在子宫内膜损伤。胞饮突为子宫内膜容受性的形态学标志物，已有研究结果发现，胞饮突参与了胚泡的黏附反应，且胞饮突的数量与胚泡着床成正比例关系，胞饮突越丰富，妊娠率越高[15]。本研究结果发现，与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜胞饮突数量显著减少，发育迟缓，体积、大小不一致，大鼠胚胎着床率及平均着床胚泡数显著降低，提示模型组大鼠存在胞饮突数量少且发育不良、胚胎着床率及平均着床胚泡数降低的现象。

A.对照组；B.模型组；C.来曲唑低剂量组；D.来曲唑中剂量组；E.来曲唑高剂量组A.control group; B.model group; C.LE-L group; D.LE-M group; E.LE-H group图4 免疫组化分析大鼠子宫内膜中eNOS表达(×400)Fig 4 Expression of eNOS in endometrium of rats by immunohistochemical analysis (×400)

来曲唑是一种非甾体、高选择性芳香酶抑制剂，其通过抑制雌激素生物合成途径的最后一步来阻断雌激素合成，已被广泛用于诱导无排卵性不孕症患者的排卵和增加排卵女性的卵泡[16]。已有研究结果发现，来曲唑与克罗米芬联合治疗可显著提高多囊卵巢综合征患者的排卵率及妊娠率[17]；来曲唑通过改善多囊卵巢综合征患者的子宫内膜容受性来提高妊娠率[18]。而关于来曲唑对超促排卵大鼠子宫内膜容受性的影响鲜有报道。本研究结果发现，与模型组比较，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠子宫内膜增生，固有层疏松水肿，血管数量增多，子宫内膜胞饮突表达增多，大鼠胚胎着床率及平均着床胚泡数显著升高，且呈剂量依赖性，提示来曲唑可能通过增加子宫内膜的厚度及血管数量，同时刺激子宫内膜胞饮突的表达，来提高子宫内膜容受性，进而使胚胎着床率及平均着床胚泡数升高。

VEGF是在子宫内膜新生血管形成中起关键作用的一种分子，子宫内膜血流量的丰度直接影响子宫内膜容受性，因此，VEGF被认为与子宫内膜容受性密切相关[19]。一项研究结果表明，VEGF可以通过促进子宫内膜的容受性来提高胚胎着床率[20]。该结果证实了VEGF在提高子宫内膜容受性中的重要性。eNOS作为调控NO合成的限速酶，其活性直接影响NO水平[14]。有研究结果表明，低水平的NO可导致子宫内膜血管通透性降低，而子宫内膜血管通透性的升高则有利于胚泡的着床率[21]。本研究结果发现，与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表达水平及平均光密度值显著降低，提示超促排卵可能影响子宫内膜血管通透性；与模型组比较，来曲唑低剂量组、来曲唑中剂量组和来曲唑高剂量组大鼠子宫内膜中VEGF mRNA、eNOS mRNA表达水平及平均光密度值显著升高，且呈剂量依赖性，提示来曲唑可提高子宫内膜容受性，使胚胎着床率及平均着床胚泡数升高，可能与VEGF、eNOS的表达升高有关。

综上所述，来曲唑可提高子宫内膜容受性，使胚胎着床率及平均着床胚泡数升高，可能与VEGF、eNOS的表达升高有关。然而，关于来曲唑对子宫内膜容受性促进作用的具体机制，有待后续实验进一步深入探究。