高效氟吡甲禾灵对海洋生物的急性毒性与水质基准推导

秦 璐，宋秀凯，刘丽娟，马元庆，姜向阳，王 宁，汝少国，王 军*

1. 中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003

2. 山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室，山东 烟台 264006

高效氟吡甲禾灵(haloxyfop-P-methyl, HPME)是一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂，能够很好地防除大多数一年生和多年生的禾本科杂草，在我国每年使用作物面积近7 万亩次，合计3×104t 以上[1]. 近年来，随着此类除草剂长期单一的不合理使用，致使其在环境中被广泛检出[2-3]. 如我国湖南某烟草基地附近水体中芳氧苯氧丙酸酯类除草剂精喹禾灵的浓度约为16 μg/L[4]，松花江水体中HPME 的浓度为3.7～9.8 μg/L[5].据报道显示，当土壤中HPME 的施用量为360～540 g/hm2时，其残留量约为0.02～0.159 mg/kg[6]；Oliveira等[7]推算出施用浓度为122.35 g/L 的HPME 会导致地表径流中HPME 浓度高达183 mg/L. 除了用于防治农田杂草外，HPME 还能够有效杀死我国近海入侵植物互花米草，抑制其有性繁殖和无性繁殖，被认为是防控互花米草的有效化学方法[8]. 互花米草在我国沿海滩涂的快速扩散破坏了鸟类觅食与栖息环境、改变了底栖动物群落组成，已成为滨海湿地生态系统健康的重大威胁[9]. 目前，多个沿海地区已经启动了互花米草的防治工作，这对恢复生态环境与生物多样性具有重大意义[10]. 化学方法是防治互花米草的经济、有效方法，但是施药过程会导致未被互花米草吸收的除草剂进入海洋环境，可能会对生态系统健康造成潜在危害.

目前，关于HPME 对淡水生物的毒性数据很少，对海洋生物的毒性效应研究鲜见报道. HPME 对四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)的96 h 半数效应浓度(median effect concentration, EC50)为62.8 mg/L[11]，对蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)的96 h-LC50为0.3 mg/L[12]. HPME 还会对水生生物的生长发育产生毒性效应. 例如，0.723 mg/L HPME 暴露会导致斑马鱼胚胎发育不良，并且3.617 mg/L HPME 暴露24 h会造成斑马鱼胚胎死亡[13]. 此外，1 mg/L HPME 暴露斑马鱼仔鱼72 h 会引发脊柱变形、运动减慢、心率和存活率明显下降等现象[14-15]. 可见，在互花米草治理过程中盲目地使用HPME 很可能造成较大的生态危害. 因此，亟需确定HPME 的生态安全阈值，并制订其水质基准.

水质基准是指污染物对人或其他生物不产生有害影响的最大可接受剂量[16-18]. 国际上水质基准的推导多采用物种敏感性分布(species sensitivity distribution, SSD)和物种敏感性排序法(species sensitivity rank, SSR). 水质基准的推导依赖于化合物的毒性数据库[19]. 例如，US EPA 制定的“推导保护水生生物及其用途的水质基准的技术指南”中指出，至少需要3 门8 科毒性数据要求[16]. 鉴于目前缺乏HPME 对海洋生物的毒性数据，该研究首先选取了8门13 科本地海洋生物开展HPME 急性毒性试验. 同时，通过搜集现有毒性数据与相关文献，构建了HPME 对水生生物的毒性数据库. 随后，利用SSD 法和SSR 法分别推导HPME 的水质基准，以期为HPME在互花米草治理中的安全施用与风险评估提供依据.

1 材料与方法

1.1 毒性数据的搜集与筛选

该文所采用的HPME 毒性数据来自于国内外已有的毒性数据库和文献资料，主要来源包括US EPA的ECOTOX 毒性数据库(https://cfpub.epa.gov/ecotox)、NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、中国知网(http://www.cnki.net). 急性毒性数据主要选取24～96 h 的LC50和EC50[20]，在筛选数据过程中，如果一个物种有多个符合要求的数据，取其几何均值来代表该物种的生物毒性数据[21].

1.2 急性毒性试验

该文使用的HPME (CAS 号95977-29-0)乳油，购自江苏中旗科技股份有限公司，有效成分含量为108 g/L. 用灭菌海水配置有效浓度为4.5 mg/L 的母液，避光保存于4 °C，每天配置新的母液.

该文选取8 门13 科13 种具有代表性的本地海洋生物进行研究，涵盖初级生产者、初级消费者、次级消费者3 个营养级. 急性毒性试验方法参照我国国家标准(GB/T 27861—2011《化学品 鱼类急性毒性试验》、GB/T 21805—2008《化学品 藻类生长抑制试验》、GB/T 13266—1991《水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》)等标准试验方法进行. 根据预试验确定暴露浓度梯度范围，每种生物设置不同HPME 浓度梯度暴露组(见表1)和灭菌海水空白对照组. 所有试验动物试验期间均不喂食，采用半静态暴露，每隔24 h 更换一次暴露液，每个浓度组设置3个平行，每个平行组包含至少10 个生物体. 试验期间每天测定温度、盐度和pH 等，以保证试验环境稳定.藻类急性毒性试验以藻细胞数量为终点指标，动物急性毒性试验以个体存活数为终点指标. 每24 h 进行1～3 次观察记录，及时捞出死亡个体，以防污染水质.所得试验数据使用GraphPad Prism 8 绘制藻类生长抑制率曲线以及剂量效应曲线，采用SPSS 16 和Probit 方法计算LC50、EC50及相应的95%置信区间.

表 1 高效氟吡甲禾灵对13 种本地海洋生物的急性毒性试验Table 1 The exposure concentration gradients of haloxyfop-P-methyl to 13 native marine organisms

1.3 水质基准推导

1.3.1 SSD 法

将毒性数据分为两组：该研究开展的13 种海水生物毒性数据与7 种淡水+13 种海水生物毒性数据.采用Log-logistic、Gamma、Log-normal、Log-gumbel、Weibull 等5 种模型分别对两组毒性数据进行拟合，构建HPME 的SSD 曲线，并采用赤池信息量准则(Akaike′s information criterion, AIC 准则)、样本修正的赤池信息准则(Akaike′s information criterion corrected for sample size, AICC)、贝叶斯信息准则(Bayesian information criterion, BIC)、 Kolmogorov Smirnov 检 验(KS 检 验)和Anderson-Darling 检 验(AD 检验)方法评估吻合度拟合效果[22-23]. SSD 模型构建及吻合度检验使用统计软件R 3.5.2 中的ssdtools 包完成. 最优SSD 曲线使用Matlab (2012 b)进行拟合.

1.3.2 SSR 法

将两组数据根据物种属名分类，分别有13 属和19 属，计算同一属内所有物种急性毒性数据的平均值，即属平均急性值(genus mean acute value, GMAV)，将GMAV 从小到大进行排序并分配等级n，两组数据GMAV 最小的4 个属及等级均为伪镖水蚤属(安氏伪镖水蚤)，1 等级；猛水蚤属(日本虎斑猛水蚤)，2等级；臂尾轮虫属(褶皱臂尾轮虫)，3 等级；等鞭金藻属(球等鞭金藻)，4 等级. 按P=n/(N+1)(N为属的个数)计算累积概率；按式(1)～(4)[16]计算最终急性值(final acute value, FAV)，其中FAV 对应SSD 法的HC5[24].

式中：S、L、A均为FAV 计算的过程量；P为选择4个属毒性数据的排序百分数(也称累积概率). 数据的分类汇总及SSR 法计算在Excel 软件中完成.

2 结果与讨论

2.1 毒性数据收集和筛选

该文共收集到HPME 对7 种淡水生物的急性毒性数据，所涉及生物分属于3 门5 科，包括2 种鱼类、4 种藻类和1 种甲壳动物(见表2). HPME 的急性毒性数据范围为0.3 mg/L (蓝鳃太阳鱼，96 h-LC50)到62.8 mg/L(四尾栅藻，96 h-EC50)，二者相差约210 倍.有研究表明，与HPME 同为芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的恶唑酰草胺(10%乳液)对斜生栅藻的72 h-EC50为1.698 mg/L，对斑马鱼的96 h-LC50为0.432 mg/L，对藻类的毒性低于对鱼类的毒性[28]，这与该文搜集数据的结果相一致. 因此，芳氧苯氧丙酸酯类除草剂对鱼类的急性毒性要明显高于藻类，提示这类除草剂会对高等水生动物产生更大的毒性效应.

表 2 高效氟吡甲禾灵对7 种淡水生物的急性毒性数据Table 2 Acute toxicity data of haloxyfop-P-methyl to 7 freshwater organisms

2.2 急性毒性试验

以暴露浓度为横坐标，以基于生长量的生长抑制率或存活率为纵坐标绘制剂量-效应折线图(见图1).HPME 的急性毒性数据范围为0.107～47.111 mg/L(见表3)，并且藻类的生长抑制率和其他生物的死亡率均与HPME 的浓度呈正相关. 不同生物对HPME 的敏感性表现为安氏伪镖水蚤＞虎斑猛水蚤＞褶皱臂尾轮虫＞球等鞭金藻＞许氏平鲉＞中肋骨条藻＞黑褐新糠虾＞四角蛤蜊＞刺参＞紫贻贝＞蛋白核小球藻＞琵琶拟沼螺＞牡蛎. 对HPME 最敏感的物种安氏伪镖水蚤的96 h-LC50值(0.107 mg/L)与最不敏感物种牡蛎的96 h-LC50值(47.111 mg/L)在数值上相差400 多倍，这与该研究数据库搜集的结果相一致. 有研究[28]显示，恶唑酰草胺乳油对大型溞和斑马鱼的48 h-LC50和96 h-LC50分别为0.112 和0.432 mg/L，属高毒；对斜生栅藻的72 h-EC50为1.698 mg/L，属中毒. 氰氟草酯对斑马鱼成鱼和胚胎的96 h-LC50分别为4.05 和0.57 mg/L，精喹禾灵对斑马鱼胚胎的96 h-LC50为0.23 mg/L，为高毒[29]. 此外，氰氟草酯对隆线溞的毒性也高于蛋白核小球藻，对隆线溞的48 h-LC50为51.91 mg/L，而200 mg/L 氰氟草酯仅抑制58%蛋白核小球藻生长[30-31]. 在该研究中，HPME 对中肋骨条藻和球等鞭金藻的96 h-LC50在0.233～0.604 mg/L 之间，而对蛋白核小球藻的96 h-LC50则高达2.396 mg/L，与紫贻贝的数值相近. 可见，不同生物对芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的敏感性存在较大差异. 为准确评估这类污染物的生态风险，非常有必要补充更多物种的毒性数据.

表 3 高效氟吡甲禾灵对13 种本地海洋生物的急性毒性试验结果Table 3 Acute toxicity results of haloxyfop-P-methyl to 13 native marine organisms

2.3 水质基准推导结果

2.3.1 SSD 法

SSD 法是一种基于统计的方法，将不同生物对污染物的敏感性分布通过一定的函数进行拟合，构建物种的敏感性分布曲线，求得能保护一定百分比生物的环境浓度值，通过有限物种的可接受水平代表整个生态系统，据此可推算出基准阈值[32-33]. 目前，一般以保护95%生物的污染物浓度，即HC5 作为安全阈值[34]，HC5 除以一个评估因子(assessment factor, AF，取值范围为1～5)即可得到水生生物水质基准[35]. 该评估因子的选择需要考虑数据质量、毒性终点的选择、数据所包含物种的多样性和代表性、化学物质的作用模式、统计过程的不确定性等. 然而，目前还没有有效方法来定量这些不确定性，大部分研究中AF 取值为2[36]. 如张瑞卿等[37]推导无机汞的水质基准、Li等[38]推导铅的水质基准以及Lei 等[39]推导4 壬基酚的水质基准时，均取2 作为AF 值. 因此，该文也选取2 作为AF 计算基准阈值. 采用5 种分布模型拟合了SSD 曲线，发现5 种模型均能成功地拟合两组毒性数据(见图2).

图 1 不同浓度高效氟吡甲禾灵暴露对13 种本地海洋生物存活率的影响Fig.1 Effects of haloxyfop-P-methyl exposure on survival rates of 13 native marine organisms

图 2 采用5 种模型构建高效氟吡甲禾灵对水生生物毒性的物种敏感性分布(SSD)曲线Fig.2 Species sensitivity distribution (SSD) curves of haloxyfop-P-methyl toxicity to aquatic organisms calculated by 5 models

通过不同方法进一步对毒性数据的拟合效果进行检验(见表4)，结果显示，KS 和AD 检验均大于0.05，AIC 和BIC 检验结果比较接近. Guthery 等[22,40-42]推荐采用AICC 确定拟合效果最好的模型，即参数delta 为0. 该研究发现log-gumbel 检验下delta 值为0，所以log-gumbel 模型更适合拟合该研究毒性数据.

表 4 高效氟吡甲禾灵的水生生物急性毒性数据检验结果Table 4 Test results of acute toxicity data of haloxyfop-P-methyl to aquatic organisms

该研究以log-gumbel 模型拟合了HPME 对水生生物的SSD 曲线(见图3). 根据所得SSD 曲线可知，甲壳纲动物对HPME 较为敏感，相比之下藻类和软体动物类群敏感度较低. 已有研究表明，与HPME 同为手性除草剂的苯醚甲环唑对甲壳纲的生物毒性大于藻类[43]，这与该研究的结论一致.

图 3 采用log-gumbel 模型构建高效氟吡甲禾灵对水生生物毒性的物种敏感度分布(SSD)曲线Fig.3 Species sensitivity distribution (SSD) curves of haloxyfop-P-methyl toxicity to aquatic organisms calculated by log-gumbel models

根据拟合曲线，基于两组毒性数据可得HPME的HC5 分别为74.1 和89.5 μg/L. 除以AF 因子得到HPME 的海水水质基准为37.05 μg/L，而基于7 种淡水+13 种海水生物毒性数据的水质基准为44.75 μg/L. 欧盟规定在推导海水水质基准时不严格排斥淡水生物的毒性数据，因此多将海水和淡水生物的毒性数据一并使用[44]. 我国海岸线较长，污染物出现短期高浓度暴露的情况多发生于河口、港区、沿岸工业/市政排污口等区域，这些区域栖息着广盐性的水生生物. 因此，推导我国海水水质基准的毒性数据应包括海水和淡水生物的毒性数据[45]. 该文基于海水数据推导出HPME 的海水水质基准与基于海水及淡水数据所推导的HPME 水质基准相差不大. 因此，在推导芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的海水水质基准时，可以采用淡水生物毒性数据进行适当的补充.

2.3.2 SSR 法

对毒性数据的敏感度排序结果显示，13 种海水生物的FAV 值为78.85 μg/L，除以AF 得出HPME 的水质基准为39.43 μg/L (见表5). 7 种淡水+13 种海水生物的FAV 值为83.30 μg/L，水质基准为41.65 μg/L，这与SSD 法推导的基准值相差较小. SSR 法最终用于计算基准值的只是4 个属的毒性数据，最终的基准值很大程度上依赖于敏感物种的数据，而SSD 法则更多依赖整体毒性数据[46]，可见该研究选取的物种对HPME 整体较为敏感.

表 5 物种敏感性排序法(SSR)推导高效氟吡甲禾灵对水生生物水质基准的参数运算Table 5 Parameter calculation for deriving quality criteria for haloxyfop-P-methyl to aquatic organisms by species sensitivity rank (SSR) method

3 结论

a) HPME 对13 种本地生物的LC50/EC50在0.103～47.111 mg/L 之间，安氏伪镖水蚤为最敏感物种，牡蛎为最不敏感物种.

b) 基于该研究获得的13 种海洋生物的毒性数据，利用SSD 法推导出HPME 的海水水质基准为37.05 μg/L，略低于基于所有毒性数据推导的水质基准(44.75 μg/L).

c) SSR 法推导出HPME 的海水水质基准为39.43 μg/L，而基于所有毒性数据推导的水质基准为41.65 μg/L.

d) 该文构建了HPME 的水生生物毒性数据库，推导出了HPME 的海水水质基准，为HPME 在我国海域开展互花米草的化学防治提供了可参考的生态安全阈值.