黄芪总黄酮通过调节Notch-Wnt 信号通路对强直性脊柱炎模型大鼠炎症反应和成纤维细胞成骨转化的影响

2022-06-22焦士军李岩韦中阳刘瑞端

广东药科大学学报 2022年3期

焦士军，李岩，韦中阳，刘瑞端

（1.安阳市人民医院骨外一科，河南安阳 455000；2.桂林医学院附属医院脊柱外科，广西桂林 541001）

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一种免疫介导的关节炎，属于脊柱关节病类，主要影响中轴骨骼，特别是骶髂关节和脊柱关节，其特征为软骨硬化和骨质增生导致的关节骨性强直，表现为关节慢性疼痛、活动度降低，伴随背部疼痛和僵硬，严重者甚至出现残疾，且患虹膜炎、骨质疏松和脊柱压缩性骨折的风险大大增加[1]。治疗以控制炎症、减轻症状、防止关节畸形为目的，包括物理治疗、运动锻炼和药物治疗等，其治疗药物主要包括非甾体类抗炎药、柳氮磺胺吡啶等[2]，但多具有胃肠道反应以及损伤肝、肾功能等副作用，且对骨骼改善作用有限[3]，因此寻找更为安全有效的天然药物成为当前的研究重点。现代药理学研究表明黄芪具有多靶点调节免疫的作用，被广泛用于免疫相关疾病治疗[4]。黄芪总黄酮是中药黄芪的活性成分，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[5]，Yang等[6]发现黄芪总黄酮可通过抑制JNK/AKT/NFκB 信号通路减轻自身免疫性脑脊髓炎小鼠小胶质细胞介导的炎症。本研究以AS大鼠为研究对象，探究黄芪总黄酮对其炎症反应和成纤维细胞成骨转化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级Wistar 雄性大鼠72 只，6 周龄，体质量200～225 g，购于河南省实验动物中心，生产许可证号：SCXK（豫）2017-0001。实验经安阳市人民医院伦理委员会批准，符合3R原则。

1.2 主要仪器、药品、试剂

GL-23M 高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；HSA-M1812酶联免疫检测仪（深圳海思安生物技术有限公司）；DYCZ-24DH 双板垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；牛软骨蛋白聚糖、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（美国Sigma公司）；黄芪总黄酮（TFA：质量分数95%，成都埃法生物科技有限公司）；柳氮磺胺吡啶肠溶片（上海福达制药有限公司，国药准字H31020840）；大鼠白细胞介素(Interleukin 6，IL-6)、IL-1β、IL-8 ELISA 试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素（bone gla protein, BGP）、Ⅰ型前胶原氨基端前肽（procollagen typeⅠN-terminal propeptide,PINP）检测试剂盒（南京建成生物研究所）；骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin抗体（Abcam公司）。

1.3 方法

1.3.1 AS模型建立及药物干预大鼠适应性喂养7 d后，按照潘金洋等[7]的方法复制AS 大鼠模型。制备免疫刺激制剂：将1 mg/mL 牛蛋白聚糖分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1∶1比例冰上乳化混合。除空白对照组外，其余大鼠均腹腔注射牛蛋白聚糖-弗氏完全佐剂混合液0.2 mL，第14、28 天腹腔注射牛蛋白聚糖-弗氏不完全佐剂混合液0.2 mL，空白对照组同时腹腔注射等体积生理盐水-弗氏不完全佐剂混合液0.2 mL。

造模22 周，观察大鼠是否出现关节活动受限和脊柱僵硬情况，判断AS 模型是否成功建立后开始药物干预，根据文献[8]，黄芪总黄酮各剂量组分别给予25、50、100 mg/kg 灌胃，阳性药物组给予柳氮磺胺吡啶825 mg/kg 灌胃，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，1 次/d，持续28 d。

末次治疗1 h 后，10%（φ）水合氯醛麻醉大鼠，取腹主动脉血5 mL，静置2 h后离心分离血清，分离大鼠脊柱，切下椎间盘并分离椎间盘上下的软骨终板，PBS冲洗去除附着表面的血液、组织。脊柱软骨和血清均保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 ELISA检测血清、脊柱组织炎症因子脊柱软骨匀浆裂解后，与血清分别按照试剂盒要求加入对应试剂、孵育洗板后，酶标仪测定吸光度（A450）。

1.3.3 显色法检测ALP、BGP、PINP 含量按照试剂盒说明书要求提前制备工作液，96 孔板的待测样本孔中加入5 μL 稀释后的血清，50 μL 缓冲液和基质液，37 ℃水浴15 min，加入150 μL 显色剂，混匀后酶标仪测定A520。

1.3.4 Western blot检测蛋白表达脊柱软骨匀浆裂解后，水浴变性，蛋白定量后上样电泳，经转模、显色，凝胶成像系统拍摄蛋白条带图片，Image J 软件分析条带灰度值。

1.4 统计学方法

所有实验均设置3 个复孔，采用SPSS 24.0 进行统计学分析，实验数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪总黄酮对AS模型大鼠炎症反应的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清、脊柱组织中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪总黄酮中、高剂量组和阳性药物组血清、脊柱组织中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均显著降低（P<0.05）。见表1、2。

表1 黄芪总黄酮对AS 模型大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-8 水平变化的影响Table 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levelsof serum IL-6,IL-1β and IL-8 in AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

与空白对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05。

组别空白对照组模型组黄芪总黄酮低剂量组中剂量组高剂量组阳性药物组IL-669.70±11.41160.09±18.32*144.22±18.16101.04±16.42#91.07±12.70#77.72±13.38#IL-1β 90.70±21.53200.97±24.23*182.44±31.68142.03±33.16#121.26±23.33#106.93±21.87#IL-863.32±14.31163.24±29.83*145.19±19.31110.43±14.70#88.30±16.29#82.48±13.67#

2.2 黄芪总黄酮对AS模型大鼠ALP、BGP、PINP影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清ALP 活性、BGP 含量升高（P<0.05），PINP 含量降低（P<0.05）；与模型组比较，黄芪总黄酮中、高剂量组和阳性药物组血清ALP 活性、BGP 含量降低（P<0.05），PINP含量升高（P<0.05）。见表3。

表2 黄芪总黄酮对AS 模型大鼠脊柱组织IL-6、IL-1β、IL-8水平变化的影响Table 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of IL-6,IL-1β and IL-8 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)ρ/(pg·mL-1)

与空白对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05。

组别空白对照组模型组黄芪总黄酮低剂量组中剂量组高剂量组阳性药物组IL-660.11±17.55127.98±22.58*111.69±23.8991.47±20.25#80.52±17.02#79.04±16.69#IL-1β 74.26±6.74149.52±9.56*137.53±14.59113.07±11.36#103.32±13.44#92.36±12.81#IL-8183.56±23.67328.77±21.52*294.35±28.33255.10±21.50#225.12±24.06#224.69±17.49#

表3 黄芪总黄酮对AS 模型大鼠血清ALP、BGP、PINP 变化的影响Table 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of serum ALP,BGP and PINP in AS rats (±s,n=12)

与空白对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05。

组别空白对照组模型组黄芪总黄酮低剂量组中剂量组高剂量组阳性药物组ρ(ALP)/（U·L-1）12.69±2.0424.11±3.26*22.73±0.9819.07±1.37#16.68±1.81#15.95±1.04#ρ(BGP)/（mg·L-1）1.11±0.211.84±0.25*1.67±0.261.54±0.24#1.44±0.22#1.40±0.22#ρ(PINP)/（ng·mL-1）47.41±4.0125.38±1.97*28.29±2.3034.70±2.39#40.52±3.12#42.73±2.83#

2.3 黄芪总黄酮对AS 模型大鼠成纤维细胞成骨转化的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠脊柱组织中BMP-2、TGF-β1 蛋白表达水平降低（P<0.05）；与模型组比较，黄芪总黄酮中、高剂量组和阳性药物组脊柱组织中BMP-2、TGF-β1 蛋白表达水平升高（P<0.05）。见图1。

图1 黄芪总黄酮对AS模型大鼠脊柱组织BMP-2、TGF-β1蛋白表达水平变化的影响Figure 1 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of BMP-2 and TGF-β1 in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

2.4 黄芪总黄酮对Notch-Wnt信号通路影响

与空白对照组比较，模型组大鼠脊柱组织中Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin 蛋白表达水平均升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪总黄酮中、高剂量组和阳性药物组脊柱组织中Notch1、Hes1、Wnt1、βcatenin蛋白表达水平均降低（P<0.05）。见图2、3。

图2 黄芪总黄酮对AS模型大鼠脊柱组织Notch信号通路蛋白表达水平变化的影响Figure 2 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of Notch signaling-associated proteins in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

图3 黄芪总黄酮对AS模型大鼠脊柱组织Wnt信号通路蛋白表达水平变化的影响Figure 3 Effects of total flavonoids of astragalus on the levels of Wnt signaling-associated proteins in spinal tissues of AS rats(±s,n=12)

3 讨论

关节炎症反应是AS 的主要特征，IL-1α、IL-1β基因位点的多态性与AS 易感性相关，NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β在AS中呈高表达[9-10]。血清IL-6、IL-8水平可作为AS辅助诊断和疾病活动度评价的重要指标[11]。黄芪是临床常用中药，具有补气固表、托毒排脓等功效，现代药理学研究表明黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪总黄酮等主要活性成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种药理作用[12]。马历历等[13]发现黄芪总黄酮可减轻脑缺血再灌注造成的氧化应激和炎症反应，抑制神经元凋亡。研究表明黄芪总黄酮通过调控NF-κB 信号通路发挥抗炎和免疫作用[14]。本研究中，经黄芪总黄酮干预的AS 大鼠血清和脊椎组织中IL-6、IL-1β和IL-8 水平均显著降低，这与万宝年等[15]的研究结果类似，表明黄芪总黄酮可减轻AS大鼠炎症反应。

脊柱和周围关节的异位骨化也是AS 的重要疾病过程，在AS 晚期，软骨逐渐被骨骼取代，出现关节强直，最终导致残疾。成纤维细胞是结缔组织的主要细胞类型之一，能产生富含胶原的细胞外基质，在特定条件下可分化为成骨细胞，参与AS 异位骨化，多种骨生长因子参与调节细胞增殖、分化和骨代谢[16]。成骨细胞特异性分泌蛋白和细胞外基质矿化能力可准确反映成骨分化程度，ALP 是一种与骨矿物质形成相关的成骨细胞分化标志物，BGP 主要由成骨细胞合成，PINP 是反映骨代谢的指标，在骨形成时释放[17-18]。成纤维细胞在特定的细胞因子刺激下才能转化为成骨细胞，BMP-2 是活性最高的骨形态发生蛋白，通常与TGF-β超家族一同诱导成骨分化。本研究中，黄芪总黄酮中、高剂量组和阳性药物组大鼠血清ALP 活性降低，BGP 含量降低，PINP 含量升高，脊柱组织中BMP-2 和TGF-β1 蛋白表达均升高，这与叶松庆等[19]的研究结果一致，表明黄芪总黄酮可调控AS大鼠成纤维细胞成骨转化。

Notch 信号通路在骨骼发育和代谢中起关键作用，也会影响骨折后骨重塑和再生过程。Notch 受体和配体在各种骨细胞中存在差异表达，功能也不相同，Notch1 通过抑制Runx2 抑制成骨细胞分化，Notch2 可刺激破骨细胞生成[20]。在AS 发生发展过程中，Notch 信号通路可与其他信号通路共同被激活，骨细胞中Wnt/β-catenin 信号通路的激活会增加骨形成、骨矿物质密度和松质骨体积，β-catenin通过Notch 配体Jagged1 与Notch 链接，也有研究表明Notch 胞内段稳定了胞质内β-catenin，从而延长了Wnt 信号[21-22]。本研究中，黄芪总黄酮中、高剂量组和阳性药物组大鼠脊柱组织中Notch1、Hes1、Wnt1、β-catenin 蛋白表达水平均降低，这与任磊等[23]的研究结果类似，表明黄芪总黄酮可通过抑制Notch-Wnt信号通路改善AS。

综上所述，中、高剂量黄芪总黄酮可改善AS 大鼠炎症反应和成纤维细胞成骨转化，这可能与其能抑制Notch-Wnt信号通路相关。