HPLC-QAMS同时测定屏风生脉胶囊中9个指标成分含量△

黄孝权，何人大，魏谭军，周殿儒，肖成，陈飞，周晓维*，陈勇

1.达州市中西医结合医院，四川 达州 635000；2.成都地奥集团天府药业有限公司，四川 达州 635027

屏风生脉胶囊由黄芪、防风、麦冬、人参、白术、五味子和附子组成，主要用于心悸气短、表虚自汗、乏力眩晕、易感风邪。现代研究表明，屏风生脉胶囊对慢性荨麻疹[1-2]、支气管哮喘[3-4]、室性早搏[5]、病毒性心肌炎[6]及老年冠心病心绞痛[7]治疗效果显著，易被广大患者接受。屏风生脉胶囊中黄芪补气升阳、固表止汗、生津养血、行滞通痹；防风祛风解表、止痛止痉；麦冬养阴生津、润肺清心；人参大补元气、补脾益肺、生津养血、安神益智；白术健脾益气、燥湿利水；五味子收敛固涩、益气生津、补肾宁心；附子回阳救逆、散寒止痛。诸药合用，共奏固卫御风、益气养阴之功效。目前，屏风生脉胶囊国家药品标准[8]及文献[9-13]中仅以1或2个成分作为质量控制指标，均难以客观评价其整体质量，也难以确保临床疗效的一致性，多指标控制模式已逐步应用于中药及其制剂的质量评价中。传统的多指标控制模式因某些对照品不易得到或部分对照品价格昂贵、稳定性差，推广应用具有一定的局限性，而一测多评法（QAMS）以制剂中某一质量稳定、价格低廉、易得的指标成分作为内参物，通过相对校正因子（RCF）计算其他成分的含量，最终达到多个组分的同时测定，有效地解决了部分对照品不稳定、价格昂贵、不易获得、检验成本过高等传统多成分质量控制模式的不足。本研究以屏风生脉胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B 为质量控制指标，采用高效液相色谱一测多评法（HPLC-QAMS）对上述9 个成分含量进行同步测定，建立屏风生脉胶囊多指标成分质量控制模式，以期为屏风生脉胶囊质量控制新体系提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（安捷伦公司）、LC-2030 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB265-S型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BRANSON 5510 型超声提取器（上海沪沁仪器设备有限公司）。

1.2 试药

对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素苷（中国食品药品检定研究院，批号分别为111920-201907、111522-201913，纯度分别为96.8%、94.6%）；芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B（成都普瑞法科技开发有限公司，批号分别为PRF9060501、PRF8101143、PRF8091225、PRF9122902、PRF9121702、PRF8041122、PRF7102423，纯度分别为99.6%、99.1%、99.9%、99.5%、99.1%、99.9%、98.3%）；屏风生脉胶囊（每粒装0.33 g）分别购于绵阳一康制药有限公司（批号分别为191001、200501、201101、210201，编号为S1～S4）、广州诺金制药有限公司（批号分别为8421101、8421302、8421501、8421503，编号为S5～S8）和山西康威制药有限责任公司（批号分别为1130109、1130111、1130118、1130311，编号为S9～S12）；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

阴性对照试验所用药材黄芪（批号：210103-1）、防风（批号：210215-2）、麦冬（批号：210116-1）、人参（批号：210302-2）、白术（批号：210107-1）、五味子（批号：201201-1）和附子（批号：210211-2）均来源于四川仁禾中药饮片有限公司，经达州市中西医结合医院周晓维主管药师鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取9 个对照品各适量，精密称定，用甲醇制成毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B 质量浓度分别为0.536、0.352、0.430、0.874、1.316、0.498、0.376、0.272、0.218 mg·mL–1的混合对照品储备液。将混合对照品储备液稀释20 倍得对照品溶液（毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B 质量浓度分别为26.8、17.6、21.5、43.7、65.8、24.9、18.8、13.6、10.9 μg·mL–1）。

2.2 供试品溶液的制备

取屏风生脉胶囊内容物2 g，精密称定，加甲醇20 mL，对供试品超声处理45 min，放冷，甲醇稀释至25 mL，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为屏风生脉胶囊供试品溶液。取按屏风生脉胶囊质量标准项下处方和制法制备的缺黄芪、缺防风、缺麦冬的阴性供试品各适量，按上述方法依次制得阴性供试品溶液。

2.3 色谱条件及系统适用性

色谱柱Agilent ZORAX StableBond C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30 ℃；检测波长分别为254 nm（0～36 min，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷）[14-20]和296 nm（36～60 min，麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B）[21-23]；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～9 min，13%A；9～24 min，13%～33%A；24～36 min，33%～45%A；36～52 min，45%～68%A；52～60 min，68%～13%A）；流速为1.0 mL·min–1；进样量10µL。理论板数按9个指标成分计均应≥5500。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 精密吸取2.1、2.2项下溶液各10µL，按2.3项下色谱条件进样检测，记录色谱图（图1）。结果屏风生脉胶囊供试品溶液中9 个指标成分与相邻色谱峰分离良好，分离度均大于1.5；所检测指标成分色谱峰峰形对称，拖尾因子符合《中华人民共和国药典》2020 年版（四部）规定；阴性供试品对9个指标成分的测定无干扰。

图1 混合对照品、屏风生脉胶囊供试品及阴性供试品HPLC图

2.4.2 线性关系考察 精密吸取2.1 项下混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，置不同的20 mL 量瓶中，用甲醇定容制成6 个混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件进样10µL，以9 个指标成分质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归（表1）。

表1 屏风生脉胶囊中9个指标成分的线性关系

2.4.3 精密度试验 按2.3项下色谱条件进样屏风生脉胶囊（编号：S1）同一份供试品溶液10µL，重复操作6 次，测得指标成分峰面积的RSD 分别为1.26%、1.33%、1.20%、0.87%、0.61%、1.19%、1.35%、1.29%、1.45%。

2.4.4 重复性试验 按2.2 项下方法制备6 份屏风生脉胶囊（编号：S1）供试品溶液，依次进样10µL分析，得指标成分含量的RSD 分别为1.57%、1.77%、1.69%、1.45%、1.09%、1.86%、1.74%、1.83%、1.91%。

2.4.5 稳定性试验 分别于0、2、4、8、16、24 h按2.3项下色谱条件进样屏风生脉胶囊（编号：S1）同一份供试品溶液10 µL，得指标成分峰面积的RSD分别为1.38%、1.41%、1.26%、0.95%、0.58%、1.12%、1.29%、1.31%、1.40%。

2.4.6 加样回收率试验 取已知9 个指标成分含量的屏风生脉胶囊内容物9 份，每份1 g，精密称定，均分成3组，精密加入混合对照品溶液（毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B的质量浓度分别为0.309、0.195、0.246、0.583、0.934、0.261、0.225、0.149、0.108 mg·mL–1）0.8、1.0、1.2 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，各精密吸取10 μL，按2.3项下方法进样检测，见表2。

表2 屏风生脉胶囊中9个指标成分的加样回收率试验结果

2.5 QAMS评价模式的建立

2.5.1 RCF 的建立 按2.3项下色谱条件进样2.4.2项下6 个混合对照品溶液各10 µL，按公式（1）计算各成分RCF。

式中ƒ为校正因子，W为质量浓度，A为峰面积，k为其他待测成分，s为内参物。

以升麻素为内参物，分别计算其他8 个指标成分的RCF（表3）。

表3 屏风生脉胶囊中其他8个指标成分的RCF

2.5.2 不同仪器及色谱柱对RCF的影响 分别选用安捷伦1260 型、岛津LC-2030 型高效液相色谱仪和色谱柱（Agilent ZORAX StableBond C18、Waters Nova-Pak C18、迪马Spursil C18），进样2.1 项下对照品溶液10 µL，得升麻素对其他8 个指标成分的RCF（表4）。

表4 仪器及色谱柱对屏风生脉胶囊中其他8个指标成分的RCF的影响

2.5.3 不同流速对RCF的影响 在不同流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min–1）条件下，按2.3项下色谱条件进样2.1 项下对照品溶液10 µL，得升麻素对其他8个指标成分的RCF（表5）。

表5 流速对屏风生脉胶囊中其他8个指标成分的RCF的影响

2.5.4 不同柱温对RCF 的影响 在不同柱温（25、28、30、32、35 ℃）条件下，按2.3项下色谱条件进样2.1 项下对照品溶液10µL，得升麻素对其他8 个指标成分的RCF（表6）。

表6 柱温对屏风生脉胶囊中其他8个指标成分的RCF的影响

2.5.5 色谱峰定位 按2.3项下色谱条件进样2.1 项下对照品溶液10µL，采用相对保留时间值法对待测成分色谱峰进行定位，考察仪器（安捷伦1260 型、岛津LC-2030 型高效液相色谱仪）和色谱柱（Agilent ZORAX StableBond C18、Waters Nova-Pak C18、迪马Spursil C18）对相对保留时间的影响（表7）。

表7 不同仪器及色谱柱对屏风生脉胶囊中其他8个指标成分的相对保留时间的影响

2.6 QAMS与外标法（ESM）测定结果比较

为验证所建立的QAMS 的准确性和可行性，取3 个厂家12 批屏风生脉胶囊，按2.2 项下方法制备屏风生脉胶囊供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样分析，分别运用ESM 和QAMS计算屏风生脉胶囊中9 个指标成分的含量，比较2 种方法检测结果的差异（表8）。

表8 屏风生脉胶囊中9个指标成分含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 目标成分的选择

屏风生脉胶囊由黄芪、防风、麦冬、人参、白术、五味子、附子组成组方，方中黄芪和人参补益元气、固表止汗为君药；白术和防风健脾益气为臣药；五味子和麦冬敛阴止汗为佐药；附子温肾壮阳为使药。本研究以君药所含成分为主，兼顾臣佐药所含成分，选取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B共9个指标成分进行定量分析。

3.2 流动相的确定

首先取甲醇-水[18-20]和乙腈-水[21]为流动相，以屏风生脉胶囊中9 个指标成分的色谱峰峰形、分离效果、响应值为主要指标，兼顾检验用时、基线情况等，结果乙腈-水优于甲醇-水，但升麻素苷与升麻素不能有效分离。遂以乙腈为有机相，参考相关文献对乙腈-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.1% 甲酸溶液[14-16,22-23]进行对比考察，最终乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相梯度洗脱，对屏风生脉胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B含量进行同时检测。

3.3 供试品制备方法的确定

本研究在制备屏风生脉胶囊供试品溶液时，逐个考察了甲醇[14-15,17-21]、水[16]、80%甲醇[22]、70%甲醇[23]4 种提取溶剂及加热回流[14,20]、超声[15,17-19,21-23]2 种提取方式，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B 综合提取率为首要指标，最终确定采用甲醇超声处理45 min 为屏风生脉胶囊供试品制备方法[21]。

本研究所建立的HPLC-QAMS 结果准确，可用于对屏风生脉胶囊中9 个指标成分的同步定量分析，能够作为屏风生脉胶囊多指标成分质量控制方法；同时也反映出9 个指标成分存在一定的批间差异，表明多指标成分质量控制对稳定屏风生脉胶囊产品质量，确保临床用药疗效的一致性具有重要意义。