菜豆品种资源幼苗期耐碱性鉴定指标筛选及综合评价

苏艺 冯国军 刘大军 杨晓旭 闫志山 刘畅

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江哈尔滨 150081）

土壤盐碱化和次生盐碱化是限制世界灌溉农业可持续发展的重要因素，约11%的灌溉土地受到不同程度的盐渍化影响（李彬 等，2005；Panta et al.，2014）。由于气候、地质、水文、人为等因素不断加重，土壤盐渍化率每年都在增加（Yadav et al.，2011；商振芳 等，2019）；在我国，可使用耕地面积因为全球工业化、城市化以及土地的盐渍化快速减少（Shabala et al.，2015；Liu &Wang，2021）。我国是盐碱地大国，盐碱地面积占耕地面积的40%，其中东北盐碱地面积近340 hm（陈丽娜，2020；Feng et al.，2021）。盐碱地的预防和治理已经成为了科研的聚焦点，挑选适合在盐碱地种植的品种或具有耐碱性的种质是盐碱地预防与治理中切实可行的措施之一（高文武 等，2016）。菜豆（L.）是最重要的食用豆类作物之一，含有大量的蛋白质、纤维、碳水化合物、维生素和矿物质，几乎占全球食用豆类消耗中的一半（Duc et al.，2015；Torche et al.，2018）。豆类作物能生产富含蛋白质的果实和种子，并且能和根瘤菌共生固定土壤中的氮，为盐碱地土壤肥力的提高做出了巨大贡献（Yu et al.，2019）。菜豆在我国主要的种植地区也是我国盐碱土的主要分布区域（李建国 等，2012；刘日林 等，2015；赵宣 等，2016）。因此，开展菜豆种质资源的耐碱性鉴定和耐碱种质筛选，对于菜豆耐碱品种改良、促进盐碱地菜豆栽培具有重要的现实意义。

盐碱土根据所含盐分离子不同分为盐土、碱土和盐化-碱化的土（刘杰，2011；孙广友和王海霞，2016）。碱土中含有过量的NaCO和NaHCO，对植物的毒性比盐土更大（Feng et al.，2021）。在过去的40 年里，植物耐盐的生理及分子机制得到了大量的研究，而对植物耐碱性的研究则相对较少（Lu et al.，2021）。近年来，植物的耐碱性研究逐渐受到重视，多集中在外源物质缓解植物碱胁迫研究及其响应机理上，也有耐盐碱种质的鉴定与筛选研究，如Jeannette 等（2002）评估了来自于14 个种共132 份野生菜豆种质苗期的耐盐性，从干质量减少量、盐敏感指数、根冠比等多个方面进行综合比较评价，得出耐盐性较好的菜豆种质都起源于干旱、沿海或盐碱地区；曹帅等（2019）利用主成分分析法及模糊隶属函数法对18 个大豆品种进行耐碱性的筛选与综合鉴定；陈二影等（2019）使用主成分分析法与模糊隶属函数法对谷子耐盐碱性进行了综合评价。而关于菜豆耐碱性机理及耐碱性鉴定方面的研究却进展缓慢，鲜见报道。

本试验在水培条件下，以NaHCO模拟碱胁迫条件，测定与植物生长、生理及光合作用相关的10 个指标，使用主成分分析、模糊隶属函数法对35个菜豆品种的耐碱性进行综合评价和聚类分析，以期筛选出能快速鉴定菜豆耐碱性的重要指标及菜豆幼苗期耐碱性较强及碱敏感的品种，为菜豆耐碱种质的选育及菜豆耐碱生理研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料选用35 个菜豆品种，均由黑龙江大学园艺学团队提供，编号、品种名称及来源见表1。

表1 供试菜豆品种编号、名称及来源

1.2 试验设计

试验于2021 年7—8月在黑龙江大学植物生理实验室完成。

各品种挑选饱满健康、大小一致的种子，使用5%次氯酸钠溶液消毒5 min 后，蒸馏水冲洗2～3 min，以蛭石为培养基质，将种子播于72 孔的穴盘中，用清水浇灌至蛭石吸饱水，育苗期间及时补充水分保持蛭石湿润。育苗8 d 后，将菜豆根部蛭石用清水冲洗干净，转移至水培装置中培养，营养液配方为0.472 g·L（CaNO）·4HO、0.404 g·LKNO、0.168 g·LKHPO、0.246 g·LMgSO、27.8 mg·LEDTA-2Na、37.2 mg·LFeSO、4.55 mg·LNaBO、1.61 mg·LMnSO、0.22 mg·LZnSO、0.08 mg·LCuSO、0.02 mg·LMoO。培养条件为室温，每天12 h 光照、12 h 黑暗。培养2 d 后使用预试验中得出的最能体现品种间差异的浓度60 mmol·LNaHCO（pH 约8.5）进行碱胁迫处理，对照组不进行处理。每个品种处理4 株，3 次重复。每天向水培液中加蒸馏水至刻度线以补充水分损失。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 光合指标的测定 胁迫2 d 后，采用Cl-340便携式手持光合仪测定光合指标。每个品种选择3株生长状况一致的幼苗，每株选取1 片健康无破损真叶测量净光合速率、胞间CO浓度及气孔导度，每个叶片测量3 次取平均值。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量的测定 胁迫3 d 后，选择长势一致的幼苗真叶进行取样，取样后迅速放入液氮中，后保存于-80 ℃冰箱中，使用硫代巴比妥酸方法测定MDA 含量。每个品种3 次重复，每个重复1 株。

1.3.3 农艺性状的测定 胁迫5 d 后，选取长势一致的幼苗进行农艺性状的测定。采用直尺以子叶结为分界点测量株高与根长；以子叶结为分界点称得地上部与地下部鲜质量，烘箱中105 ℃杀青30 min后75 ℃烘干至恒重称得地上部与地下部干质量。每个品种3 次重复，每个重复1 株。

1.3.4 综合评价方法 使用模糊隶属函数（D 值）法对供试菜豆品种幼苗期的耐碱性进行综合评价及聚类分析，模糊隶属函数计算公式如下：

式中，X为各供试材料基于鉴定指标的耐碱系数；X、X分别为供试材料中该指标的最大值和最小值；μ（X）为各供试材料的隶属函数值；CV为μ（X）的变异系数；W即权重，表示CV在总变异中所占比率；D 表示菜豆品种耐碱性综合评价值。鉴定指标与耐碱性呈正相关时，用公式（1）计算隶属函数值；鉴定指标与耐碱性呈负相关时，用公式（2）计算隶属函数值；用公式（3）计算鉴定指标的权重，公式（4）计算D 值。

1.4 数据处理与分析

使用Excel 2019 整理试验数据，使用SPSS Statistics 25.0 进行相关性分析、主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 碱胁迫对菜豆幼苗生长的影响

在碱胁迫下，为消除试验材料间的差异，使用各指标的相对值能更好地体现出不同菜豆品种的耐碱性。与正常条件相比，碱胁迫明显抑制菜豆幼苗的生长。从表2 可以看出，碱胁迫下不同品种各指标变化幅度不同，株高相对值变化幅度为18.11%～100.74%，根长相对值变化幅度为56.70%～122.69%，地上部鲜质量相对值变化幅度为11.89%～75.33%，地下部鲜质量相对值变化幅度为49.56%～110.58%，地上部干质量相对值变化幅度为47.56%～106.80%，地下部干质量相对值变化幅度为59.18%～170.00%，MDA 含量相对值变化幅度为87.32%～347.35%，净光合速率相对值变化幅度为20.87%～105.17%，胞间CO浓度相对值变化幅度为14.40%～97.91%，气孔导度相对值变化幅度为7.48%～101.96%。

碱胁迫下，辉冠的株高略高于对照，美国黑虎、青冠、青条绿先锋、1-4-3-1-1 的根长高于对照，菊冠的地下部鲜质量高于对照，长龙红籽架豆的地上部干质量高于对照，绿冠、菊冠、14-4-1-3、美国黑虎、香蕉豆、辉冠、锦冠、06-1、22-5-5-1-3、1-4-3-1-1、霞冠、玉冠等12 个品种的地下部干质量均高于对照且菊冠比对照高70%。碱胁迫下，除紫冠MDA 含量低于对照外，其他品种MDA 含量均高于对照。粉冠在碱胁迫下净光合速率、胞间CO浓度和气孔导度同对照近乎一致，而其他品种净光合速率、胞间CO浓度与气孔导度几乎均被抑制。从各指标相对值可以看出，单一指标难以区分菜豆幼苗的耐碱性，因此，需综合各指标来分析菜豆幼苗耐碱性的强弱。

2.2 菜豆品种的耐碱性主成分分析

对菜豆各品种相对株高、相对根长、相对净光合速率等共10 个指标进行主成分分析，各主成分特征值及贡献率如表3 所示。前4 个主成分的贡献率分别为32.23%、23.31%、12.54%、10.06%，其累计贡献率为78.15%。成分载荷是主成分与变量的相关系数，其数值大小表示在降维后综合变量中的贡献率高低，同一个变量中，主成分绝对值越大，越能代表该变量（陈重远 等，2021）。主成分Ⅰ中，净光合速率、胞间CO浓度、气孔导度的绝对值较大，分别为0.703、0.866、0.819，表明主成分Ⅰ代表的是净光合速率、胞间CO浓度、气孔导度的信息。主成分Ⅱ中，地上部鲜质量、地下部鲜质量、地下部干质量的绝对值较大，分别为0.688、0.696、0.858，表明主成分Ⅱ代表的是地上部鲜质量、地下部鲜质量、地下部干质量的信息。主成分Ⅲ中，根长、地下部鲜质量绝对值较大，分别为0.597、0.556，表明主成分Ⅲ代表的是根长、地下部鲜质量的信息。主成分Ⅳ中，地上部干质量的绝对值较大，为0.705，表明主成分Ⅳ代表的是地上部干质量的信息。

表3 4 个主成分特征根值、贡献率及各因子载荷矩阵

表2 碱胁迫下不同菜豆品种各指标相对值 %

综合分析，由于4 个主成分反映了原来10 个指标78.15%的信息，对菜豆耐碱性的影响较大，因此可以用根长、地上部干/鲜质量、地下部干/鲜质量、净光合速率、胞间CO浓度及气孔导度等8 个指标作为菜豆耐碱性评价的重要指标。

2.3 菜豆品种耐碱性各指标隶属函数值及权重

对主成分分析法筛选出的8 个与耐碱性相关度较高的指标采用模糊隶属函数法综合评价菜豆在碱胁迫下的耐受性，各指标的权重如表4 所示，气孔导度所占权重最大，为0.156 2，其次为地下部干质量和净光合速率，分别占0.147 9 和0.126 1，占权重最小的为地上部干质量，只占0.094 3。表明气孔导度、地下部干质量及净光合速率的变化对菜豆幼苗期耐碱能力的影响较大，而地上部干质量的变化对菜豆幼苗期耐碱能力的影响较小。

表4 8 个鉴定指标的权重

2.4 碱胁迫下菜豆品种模糊隶属函数综合评价

不同品种各指标的隶属函数值如表5 所示。利用公式（4）对不同品种各个指标μ 值加权后相加得到D 值，D 值越大，耐碱性越强。按照D 值大小进行排序（表5），D 值排前5 名的分别为粉冠、菊冠、盛冠、06-1、14-4-1-3，D 值排名在后5 名的分别为44-1-1、弯钩黄、热那亚、麻子王、泰来白条。

表5 35 个菜豆品种基于8 个鉴定指标的隶属函数值、D 值及排序

续表

2.5 基于D 值对35 个菜豆品种进行聚类分析

对D 值采用欧式距离法进行系统聚类（图1），35 个菜豆品种被聚为5 类。第Ⅰ类只有1 个品种粉冠，该类群D 值最高，属于耐碱品种；第Ⅱ类包括14-4-1-3、06-1、菊冠、盛冠等4 个品种，该类群D 值相对较高，属于相对耐碱品种；第Ⅲ类包括赤裕21 号、丰冠、美国黑虎、长龙红籽架豆、22-5-5-1-3、黛冠、香蕉豆、绿冠、玉冠、祥冠、霞冠、巨冠、辉冠等13 个品种，该类群D 值中等，属于中等耐碱品种；第Ⅳ类包括44-1-1、青冠、弯钩黄、热那亚、麻子王、黄冠、锦冠、青条绿先锋、1-4-3-1-1、红旗油豆、矮生黄金勾、皇冠、金冠、优三窄、HG-911、紫冠等16 个品种，该类群D值相对较小，属于相对碱敏感品种；第Ⅴ类只有1个品种泰来白条，该类群D 值最小，属于碱敏感 品种。

图1 35 个菜豆品种的D 值聚类分析

3 讨论

3.1 碱胁迫下不同菜豆品种耐碱性指标差异

根据土壤所含盐分不同，可分为盐土和碱土，这两种土壤往往同时发生，若要解决土壤碱化问题，就要将碱胁迫和盐胁迫真正区分开（郭瑞 等，2017）。在相同浓度的NaCl 和NaHCO下，碱胁迫对菜豆幼苗的生长抑制更为严重（Yu et al.，2019）。除了氧化胁迫和离子伤害之外（Munns，2002），碱胁迫下的植物必须应对根际周围的高pH 环境（Keutgen &Pawelzik，2008），植物根系是最先感应碱胁迫的器官，高pH 会影响根系的正常生理功能、破坏细胞结构，进而导致根系的吸收能力下降（Yang et al.，2008a，2008b）。本试验中，除菊冠外，碱胁迫后菜豆幼苗地下部鲜质量明显下降，这与前人的研究结果一致（赵俊香 等，2015）。生物量是反映逆境胁迫下植物适应性的指标，可以反映逆境胁迫是否得到缓解和缓解程度（许基磊，2020）。赵俊香等（2015）进行菊芋苗期耐盐碱筛选时，耐盐碱能力较差的菊芋9 号的根部生物量为对照的2 倍，但地上生物量仅占对照的48%；燕麦苗期耐盐碱性的筛选中，燕麦幼苗盐碱胁迫后的地下部干质量均低于对照（付鸾鸿 等，2019）。本试验中，碱胁迫下大部分品种地下部干质量受到抑制，但有10 个中等耐碱及相对耐碱品种在胁迫后地下部干质量高于对照，推测菜豆的耐碱机制是通过合成更多的物质运送到根部，促进根系对抗高pH 的环境所带来的伤害及维持正常的生理功能，具体的耐碱机理有待进一步研究。

3.2 碱胁迫下不同菜豆品种耐碱性的主成分分析

主成分分析是一种解决多因素问题的有效统计方法，是将多个变量进行降维处理，将大量信息囊括在几个少数变量中，使其尽可能多地反映原来变量信息的方法（韩丽萍 等，2021）。主成分分析法充分考虑不同指标之间的信息重叠，对多维数据进行标准化，在尽可能保留原有信息的基础上，对多维数据进行降维处理，更加客观地筛选出独立的综合因子，避免了主观随意性（薛伟锋 等，2020）。该方法被广泛应用于各个领域，其中也包括使用该方法对植物的耐盐性、耐密性等进行综合评价（张国新 等，2018；郭琳钰和李振轮，2021；韩德志 等，2021；李凯 等，2021）。曹帅等（2019）使用主成分分析法得出，主根长、净光合速率可作为衡量大豆耐碱性与品种筛选的主要指标。于崧等（2018）使用主成分分析法将20 个单项指标转化为8 个相互独立的综合指标，并筛选出地上部干质量、地下部鲜质量等鉴定指标可用于不同基因型绿豆耐盐碱性强弱的快速评价与预测。张国新等（2018）使用主成分分析法筛选出地上部鲜质量、地下部鲜质量、地上部干质量、净光合速率、气孔导度等8 个指标作为综合评价菊芋耐盐性的指标。李琳等（2016）利用主成分分析法得出全株干质量、地上部鲜质量、地下部鲜质量、根长可作为芸豆苗期耐盐碱性的鉴定指标。本试验采用主成分分析法将10 个菜豆幼苗期耐碱性指标综合为4 个主成分，这4 个主成分反映了原来10 个指标78.15%的信息，对菜豆耐碱性的影响较大，因此可以用根长、地上部鲜质量、地上部干质量、地下部鲜质量、地下部干质量、净光合速率、胞间CO浓度及气孔导度等8 个指标作为菜豆耐碱性评价的重要 指标。

3.3 碱胁迫下不同菜豆品种的综合评价及聚类 分析

在非生物胁迫下，为了适应环境变化，植物细胞做出了一系列生理生化过程的改变来保证自身的正常存活与生长（Xuan et al.，2019）。尽管这些生理生化指标可以被用来描述品种间的耐碱性差异，但是很难用一个指标去准确、清晰地表达品种间的耐碱性差异（杜中军 等，2002）。因此，需要综合多个指标对菜豆各品种幼苗期的耐碱性进行评价。模糊综合评价法是借助模糊数学中的隶属度理论把定性评价转化为定量评价，即对受到多种因素制约的事物或对象做出一个整体的评价（薛伟锋 等，2020）。前人使用模糊隶属函数法对不同加工番茄品种的耐盐性（许立志 等，2017）、甜高粱孕穗期的耐盐性（高雪 等，2018）以及大豆品种苗期耐盐碱性（曹帅 等，2019）等进行了综合评价。本试验中使用模糊隶属函数法对35 个菜豆品种的耐碱性进行综合评价，并对综合评价值（D 值）进行聚类分析，将菜豆品种按照耐碱性不同分为5 类，其中，30 个菜豆品种都为中等耐碱、相对碱敏感及碱敏感品种，推测菜豆大部分品种幼苗期对碱胁迫的耐受性都不高。

4 结论

通过对35 个菜豆品种幼苗期耐碱性的10 个指标进行分析，可以看出碱胁迫对菜豆幼苗的生长及光合均有抑制作用，并且会不同程度地破坏细胞膜。通过主成分分析筛选出根长、地上部鲜质量、地上部干质量、地下部鲜质量、地下部干质量、净光合速率、胞间CO浓度及气孔导度等8 个指标可以作为菜豆幼苗期碱胁迫鉴定的重要指标，通过模糊隶属函数法综合评价和聚类分析，35 个菜豆品种可被划分为5 类：Ⅰ类为耐碱品种，只有1 个品种；Ⅱ类为相对耐碱品种，共4 个品种；Ⅲ类为中等耐碱品种，共13 个品种；Ⅳ类为相对碱敏感品种，共16 个品种；Ⅴ类为碱敏感品种，只有1 个品种。