5株假臭草来源内生真菌生物转化柠檬烯产物分析

梁佩芳，杨道茂

（1.开封大学 医学部，河南 开封 475000；2.华侨大学 化工学院，福建 厦门 361021）

单萜类物质主要存在于挥发油中，有止痛、抑菌、作昆虫信息素及昆虫驱避剂等作用，广泛应用于医药、香料等方面［1］。单萜类化合物由于结构简单、价格低廉，一直是理想的生物转化底物。细菌、真菌、酵母菌和植物细胞等都可以充当生物催化剂角色完成对柠檬烯［2］、α-蒎烯和β-蒎烯［3］的转化工作，在已报道的微生物催化剂中，细菌占41%，真菌占33%［4］。比如：在细菌中，假单胞属细菌（Pseudomonas sp.）能以D-柠檬烯为唯一碳源和能源转化合成紫苏醇［5-6］，继而进一步氧化成紫苏醛和紫苏酸［7-8］。在真菌中，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum 152b）可以将R-（+）-柠檬烯和S-（-）-柠檬烯转化为R-（+）-α-terpineol和limonene-1,2-diol［9］；指状青霉（Penicillium digitatum）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）可以将（+）-柠檬烯分别转化为α-萜品醇（α-terpineol）［10］和紫苏酸［11-12］；白曲霉可以转化（+）-柠檬烯，主要转化产物为异辣薄荷酮［13］。

除了从细菌和真菌菌种库中筛选具有生物转化剂功能的微生物外，近年来植物内生真菌在生物催化领域的作用开始受到重视，并且已经有利用植物内生真菌转化单萜化合物的文献报道。比如从海藻Bostrychia radicans分离到的内生真菌Botryosphaeria sp.能将外消旋樟脑转化为6-endo-羟基樟脑、6-exo-羟基樟脑、5-exo-羟基樟脑、5-endo-羟基樟脑、3-exo-羟基樟脑和8-羟基樟脑［14］。火炬松（Pinus taeda）来源的植物内生真菌Phomopsis sp.能转化1%的柠檬烯合成0.536 g/L香芹酮和2.08 g/L柠檬烯-1,2-二醇，如果用柑橘皮提取物为底物则生成2.10 g/L柠檬烯-1,2-二醇［15］。因此，无论从理论还是从实践上看，用植物内生真菌生物转化单萜类化合物具有可行性。

本实验选取无环单萜的月桂烯、单环单萜的（+）-柠檬烯和（-）-柠檬烯为代表，以假臭草来源的5株内生真菌作为测试菌株，采用GC-MS手段分析转化产物，以期为工业生物催化寻找合适的微生物菌种。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器与材料

试剂：（+）-柠檬烯、（-）-柠檬烯（日本东京化成工业株式会社），（1S,2S,4R）-（+）-二戊烯-1,2-二醇（Sigma-Aldrich公司），无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚均为分析纯（国药试剂有限公司）。

仪器：ZQZY-75CN振荡培养箱（上海支楚仪器有限公司）；XH-C旋涡混合器（金坛市白塔新宝仪器厂）；SW-CJ-1FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；H1650医用离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Angilent 8860 GC System-5977B GC/MSD气质联用仪器（带G4513A自动进样器，美国安捷伦科技有限公司），色谱柱为安捷伦HP-5ms Ultra Inert（30 m×250μm×0.25μm）。

材料：5株假臭草来源植物内生真菌（PS01、PS06、PS07、PS10、PL14）由华侨大学王奇志博士馈赠，经鉴定为子囊菌门［Ascomycota（Berk.）Caval.-Sm.］链格孢属（Alternaria Nees）［16］。

1.2 方法

1.2.1 气相色谱-质谱联用检测方法

气相色谱升温程序设置：在60℃下保持1 min，以20℃/min升温到300℃，保持13 min。其余系统参数设置：进样口温度为250℃，空气流量为1.0 mL/min，分流比为5∶1，氦气为载气，进样量为1μL。质谱仪参数：离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，质量扫描范围（m/z）为60～800 amu。

1.2.2 柠檬烯-1,2-二醇标准曲线

称取8.7 g的柠檬烯-1,2-二醇标准品溶解于脱水乙酸乙酯中，并稀释成不同浓度的标准品溶液，采用1.2.1所述的检测方法检测其峰面积，并做峰面积-浓度关系图。

1.2.3 菌株转化柠檬烯

5株真菌对柠檬烯的转化过程参考文献［17］并略作调整。5株真菌分别以（＋）-柠檬烯和（-）-柠檬烯为底物，在相同条件下进行生物转化。具体实验步骤：挑取一接种环的菌丝，接种到盛有50 mL无菌沙保氏培养基（10 g蛋白胨，40 g葡萄糖，1000 mL蒸馏水，pH值为4.0～6.0）的250 mL锥形瓶中，在30℃、200 r/min下培养6 d；然后在每瓶培养基中加入0.5 mL底物［V（底物）∶V（乙醇）=1∶1，各底物最终体积分数为0.5%］，在相同条件下继续培养4 d，完成转化。转化结束后，过滤发酵液，取滤液3 mL并用等体积乙酸乙酯萃取，将有机相用无水硫酸钠脱水，最后取有机相1 mL进行TLC和GC-MS检测，其中柠檬烯-1,2-二醇的含量由峰面积按照标准曲线换算而得。

2 结果与分析

2.1 柠檬烯-1,2-二醇标准曲线

按照总离子流（Total Ion Chromatography,TIC）图中柠檬烯-1,2-二醇信号峰的峰面积与样品浓度的关系，作标准曲线并进行数据拟合，其结果如图1所示。

图1 柠檬烯-1,2-二醇标准曲线

由图1可知，柠檬烯-1,2-二醇的峰面积-质量浓度的标准曲线方程为：Y=129 971.734X-15 963.437，R2=0.992。其中：Y为峰面积，X为柠檬烯-1,2-二醇质量浓度（g/L），检测范围为8.700～0.086 g/L。

2.2 底物为（+）-柠檬烯的转化产物

该5株菌转化（＋）-柠檬烯的产物的TIC图如图2所示。

由图2可知，该5株内生真菌转化（＋）-柠檬烯的共同主要产物为峰2（柠檬烯-1,2-二醇），其中PS01、PS06还多了一个峰1（环氧柠檬烯）。柠檬烯转化生成柠檬烯-1,2-二醇的代谢路线是柠檬烯的C—1,2位先环氧化，生成环氧柠檬烯中间代谢产物，然后环氧柠檬烯生成柠檬烯-1,2-二醇，属于已知的6条柠檬烯代谢路线之一［18］，因此图2的代谢产物符合柠檬烯的转化机理，是柠檬烯的生物转化产物。

由图2中PS07、PS10、PL14的TIC图可以看出，环氧柠檬烯的信号较弱或检测不出，可能是已经完全转化为柠檬烯-1,2-二醇的缘故。本实验结果与M.C.J.Bier等［19］报道的结果相一致，作者利用内生真菌Phomopsis sp.转化D-柠檬烯，其主要产物也是柠檬烯-1,2-二醇（2.08 g/L）。

积分图2中的峰2信号峰面积，再代入柠檬烯-1,2-二醇标准曲线方程，得出5株菌转化（＋）-柠檬烯所得柠檬烯-1,2-二醇产物质量浓度，其结果如图3所示。由图3可知：柠檬烯-1,2-二醇质量浓度最高为2.275 g/L，由PS07菌株转化而得；其质量浓度最低为0.341 g/L，由PS01菌株转化而得。PS01转化得到的柠檬烯-1,2-二醇产物浓度低的缘故在于其前体物质环氧柠檬烯浓度较高。

图2 内生真菌生物转化（+）-柠檬烯后的有机相TIC图

图3 5株菌转化（+）-柠檬烯生成的柠檬烯-1,2-二醇的质量浓度

2.3 底物为（-）-柠檬烯的转化产物

该5株菌转化（-）-柠檬烯的产物的TIC图如图4所示。由图4可知，内生真菌生物转化（-）-柠檬烯后，其主要产物均为柠檬烯-1,2-二醇，中间代谢产物环氧柠檬烯的信号较弱或检测不到。对比图2和图4表明，这5株内生真菌均能转化（＋）-或（-）-柠檬烯生成柠檬烯-1,2-二醇，推测该5株植物内生真菌的加氧酶对底物无立体特异性要求。

图4 生物转化（-）-柠檬烯后的有机相TIC图

按照2.2的处理方法，得出5株菌转化（-）-柠檬烯后生成柠檬烯-1,2-二醇的质量浓度，如图5所示。由图5可知，除了PS07转化（-）-柠檬烯生成的柠檬烯-1,2-二醇浓度最高达到2.179 g/L外，其余4株菌株转化后生成柠檬烯-1,2-二醇的质量浓度均在0.9～1.5 g/L之间。

图5 5株菌转化（-）-柠檬烯生成柠檬烯-1,2-二醇的质量浓度

对比该5株内生真菌对（+）-柠檬烯和（-）-柠檬烯的转化结果，得出如下结论：一是PS07菌株对手性底物转化均能保持2.0 g/L以上的产物浓度，有进一步研究的价值；二是PL14、PS10和PS06对（+）-柠檬烯和（-）-柠檬烯转化生成的柠檬烯-1,2-二醇含量差异不大，可能该3株菌相关的加氧酶对底物无特异性要求，这也与PS07的结果相一致；三是PS01菌株更加偏好（-）-柠檬烯，其转化产物浓度从（+）-柠檬烯为底物的0.34 g/L提高到（-）-柠檬烯为底物的0.94 g/L。目前有关植物内生真菌来源加氧酶与底物特异性的报道较少，还有待进一步研究。

3 讨论

5株假臭草来源内生真菌生物转化（＋）-柠檬烯时，菌株PS01和PS06主要转化产物为柠檬烯环氧化合物和柠檬烯-1,2-二醇，PS07、PS10和PL14的主要转化产物为柠檬烯-1,2-二醇。柠檬烯-1,2-二醇质量浓度最高可达2.275 g/L，由PS07菌株转化而得；最低为0.341 g/L，由PS01菌株转化而得。生物转化（-）-柠檬烯时，5株菌的主要转化产物均为柠檬烯-1,2-二醇。除了PS07转化后柠檬烯-1,2-二醇质量浓度最高达到2.179 g/L外，其余4株菌株转化后柠檬烯-1,2-二醇质量浓度均在0.9～1.5 g/L之间。

5株假臭草来源内生真菌生物转化（＋）-柠檬烯、（-）-柠檬烯均能生成不同浓度的柠檬烯-1,2-二醇，柠檬烯-1,2-二醇具有非常明显的对CD4＋和CD8＋T淋巴细胞的促炎活性的抑制活性、潜在的抗癌活性，诱虫特性等，并可以用作饮料、口香糖、明胶和布丁的调味剂。柠檬烯-1,2-二醇价格是$11 500/kg，而底物柠檬烯价格仅为$34/L，利用生物转化获取柠檬烯-1,2-二醇具有较好的经济效益。该生物转化工艺的最新报道是采用睡莲科炭疽菌（Colletotrichum nymphaeae）CBMAI 0864，用静息细胞转化的方式，柠檬烯-1,2-二醇产量可以达到4.19 g/L［20］，通过一系列工艺优化手段，在7.5 L规模的发酵罐中柠檬烯-1,2-二醇含量达到7.8 g/L［21］。因此，生物转化（＋）-柠檬烯生产柠檬烯-1,2-二醇工艺，其产物的产量离工业化生产还有较大的距离，还需要继续从高耐受底物和产物菌株筛选、发酵工艺优化、产物提取分离工艺改良［22］等角度进行深入研究。