植物乳杆菌WL-R-02冻干保护剂配方的优化

◆作者：李凤娟

◆单位：辽宁威兰生物技术有限责任公司

植物乳酸菌（LacLoba-cillus planlarum）具备免疫调节、抑制病原微生物、维持肠道菌群平衡和促进营养物质吸收等很多保健作用，同时也广泛应用于微生物制剂（刘利利等，2020）。国内冻干乳酸菌发酵剂商品化生产不足，主要原因是冻干乳酸菌发酵剂的生产技术还不是很完善，细胞存活率低，保存时间短（杜磊等，2017）。真空冷冻干燥（简称冻干）技术出现在1811年左右，当时主要用于生物体的脱水。1813年由美国人Wollaston发现水的饱和蒸汽压与水温有

关，1909年shackell将其用于了干燥细菌。经过一个世纪，在1935年第一台商业冻干机问世。目前冻干机已经在医药行业普遍应用。乳酸菌菌粉可以采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行制备。真空冷冻干燥法因获得的发酵剂含活菌数高，发酵活力强，遗传性稳定，便于储藏，携带方便，使用安全等优势而被广泛地应用（曾小群等，2013）。骆承庠、刘振民等研究发现乳酸菌经过冻融处理后，致死率增加。引起致死损伤的主要因素是机械效应、溶质效应和干燥效应（刘振民等，2002）。许多研究发现在乳酸菌冻干前加入适当的物质能起到保护作用，在冷冻干燥的细菌中加入保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性，因此对于绝大多数细菌冷冻干燥成功的关键在于有效保护剂的使用。许多研究也发现冻干保护剂不仅影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率，还影响保藏期间的细胞稳定性（张英华等，2005）。保护剂间合理的复配方式有助于优势的互补，更大程度地发挥保护效果，也是乳酸菌商业化的关键因素；正交试验设计（OrthogonalExperimentalDesign）是从“均匀分散、整齐可比”的角度出发，以拉丁方理论和群论为基础，从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验的一种方法。它利用正交表来安排与分析多因素试验，进而减少我们试验的次数，适用于因素水平不太多的多因素试验（代志凯等，2010）。本研究通过对实验室现有保护剂成分进行正交试验，确定冻干保护剂最优组合，获得冻干存活率高的乳酸菌，为开发商品化专用直投式发酵菌剂提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要材料

菌种：乳酸菌WL-R-02（威兰生物菌种库保存菌株）。

MRS培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.58 g/L。若制作固体培养基，在此基础上加入2%的琼脂粉即可。

发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉15.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，硫酸锰0.05g/L。

保护剂配料：脱脂乳（新西兰FonterraLtd生产）、海藻糖（德州汇洋生物科技有限公司生产）、乳糖（美国LeprinoFoods生产）、L-半胱氨酸（河北鹏宇生物科技有限公司生产）。

1.2 试验仪器

LYO-4.0真空冷冻干燥机、LD-5电动离心机、HYQ1800生物摇床、DH6000II型电热恒温培养箱、SW-CJ-2F洁净工作台；752紫外分光光度计。

1.3 试验方法

1.3.1 菌粉的制备与检测方法

菌泥的制备：取植物乳杆菌WL-R-02冻存管，接种于MRS培养基，37℃下厌氧静置培养12～24h。挑取具有典型形态的菌落，接种于发酵培养基，37℃下厌 氧 培 养16～20h，3000～3500 r/min条件下离心20～30min，收集菌泥。

菌粉的制备：将收集到的菌泥加入适量生理盐水重新悬浮。在菌悬液中，加入不同组别的冻干保护剂，充分搅拌溶解后，取样检测活菌数；然后，分装于西林瓶中，每瓶3mL，每组10个重复。将各组样品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥38～40h，出箱后即得冻干菌粉。取样检测有效活菌数，计算存活率。

活菌数的检测：采用MRS平板计数法，梯度稀释至约30～300个菌/mL后涂平板，置于37±1℃培养箱中培养48h后计数。

冻干存活率计算方法：

存活率/%=冻干后3mL菌悬液的活菌总数/冻干前3 mL菌悬液的活菌总数×100。

1.3.2 冻干保护剂配方优化

选定脱脂奶粉、海藻糖、乳糖、L-半胱氨酸进行四因素二水平试验（表1）。

表1 乳酸菌保护剂正交试验因素水平表

考虑脱脂乳与海藻糖、乳糖均有交互作用，海藻糖与乳糖均为小分子糖，存在交互作用；自由度f=4×1+3×1=7；根据L8（27）交互作用列表设计四因素二水平三交互实验（见表2）。

表2 乳酸菌保护剂L8（27）交互作用正交表

正交试验得出的最优复合保护剂不在正交试验组别中，则与1.3.1相同条件再次冻干，测定最终存活率。

1.3.3 耐高温考察：

最佳处理工艺条件下制备的菌粉，分别置于4℃、37℃、42℃条件下进行贮存，10d后进行取样测活菌数，计算存活率。

2 结果

2.1 冻干保护剂配方优化

复合保护剂中的物质由于种类不同，其对菌体的保护方式也不同，各保护剂成分比例不同，菌粉的活菌数也就不同（见表3），优化保护剂比例将会提高菌体的细胞存活率。

表3 保护剂配方对活菌数影响试验的结果

由表3、表4可以看出：因素中对存活率的影响依次为D＞C＞B＞B×C＞A×B＞A＞A×C，L-半胱氨酸＞海藻糖＞乳糖＞脱脂乳，其中脱脂乳的作用次于海藻糖/乳糖、脱脂乳/海藻糖的交互作用有关，根据二元表确定脱脂乳含量为A2（13%），得出保护剂组合（A2B1C1D1）可使得存活率最高，因此确定最佳复合保护剂配方为：13%脱脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1.0%半胱氨酸。

表4 保护剂配方对活菌数影响试验的结果分析

对最佳冻干保护剂组合：13%脱脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1.0%半胱氨酸。重复性试验结果冻干前乳酸菌活菌数为1.40×1010CFU/mL，冻干后乳酸菌活菌数达到了 1.28×1010CFU/mL，存活率达91.6%，最佳保护剂组合冻干后的活菌数均大于正交试验各组的活菌数，普遍高于正交各实验组结果。最终活菌数为6.70×1010CFU/g，达到了比较理想的冻干保护效果。

2.2 耐高温考察

由表5可以看出：4℃条件下10d，存活率为98.96%，趋于稳定。37、40℃条件下10d活菌数下降了1～2个数量级，存活率分别为4.48%和1.22%；显示不同温度下储存10d，随着温度的升高，存活率下降。低温有利于植物乳杆菌WL-R-02的保存。

表5 乳酸菌不同存放温度下活菌数变化情况（CFU/g）

3 讨论与结论

3.1 冻干保护剂配方优化

本试验得出针对WL-R-002乳酸菌植物的保护剂最佳配方组合为：13%脱脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1.0%半胱氨酸。在最优配方保护剂下存活率为91.6%，最高活菌数为6.70×1010CFU/g。复合保护剂比单一保护剂保护性更好，这主要是因为复合保护剂之间可能存在互补作用。本研究复合保护剂各成分对WL-R-002冻干存活率的影响主次顺序为：L-半胱氨酸＞海藻糖＞乳糖＞脱脂乳；有研究发现，L-半胱氨酸中的氨基可与菌体蛋白质上的羧基相互作用，稳定蛋白质的结构，防止冻干过程中因脱水而导致的蛋白质聚集，从而达到保护作用；同时，L-半胱氨酸具有抗氧化作用，可以防止细胞膜中不饱和脂肪酸在冷冻干燥过程中被氧化，保持细胞膜良好的流动性（CarvalhoAS，2003）。Hubel（2007）和Zayed（2004）分别从“玻璃体学说”和“水替代假说”角度表明海藻糖和小分子糖在菌体保护中的作用，海藻糖分子能减少保存以及复水过程中细菌细胞的死亡，具有明显的增强耐热的功能。海藻糖由于具有多个羟基，可以与菌体表面自由基联结起来，避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键以取代水，保证蛋白质的稳定性；另一方面在溶液中易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的黏性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护细胞的目的（Vinderola，2002）。小分子糖、山梨醇的加入可提高干燥升华速度（Santivarangkna，2007）。脱脂乳等天然合成的高分子物质，它们在冻干生物制品中主要起骨架作用，使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加（Vasiljevic，2003）。

本实验对四个候选冻干保护剂进行正交实验确定最优组合，最优复合保护剂下对WL-R-002乳酸菌冻干存活率为91.6%。秦鹏等（2016）研究发现，罗伊氏乳杆菌在保护剂配方为：低聚果糖2.66%、脱脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，冻干存活率达到89.43%。陈胜杰等（2021）研究发现，植物乳杆菌：可溶性淀粉10%，VC钠盐3%，脱脂乳粉12%，低聚木糖14%;凝结芽孢杆菌：低聚木糖8%，VC钠盐4%，可溶性淀粉14%，脱脂乳粉8%;酿酒酵母菌：低聚木糖10%，VC钠盐2%，脱脂乳粉12%，可溶性淀粉12%。添加最优保护剂组合，三株菌的冻干存活率分别为83.2%、83.7%和86.7%，从实验结果来看，不同的菌株对冻干保护剂的复配配方需求也不尽相同，比例也各有差别，说明菌株本身的特性也是影响保护剂选择的主要因素。辛国芹等（2021）研究发现，通过正交试验筛选出植物乳杆菌保护剂配方：脱脂奶粉25%，海藻糖7.5%，甘油0.75%，冻干存活率可达91.01%。景安琪等（2021）研究发现，植物乳杆菌菌株686在保护剂配方为脱脂乳12.5g/100 mL，海藻糖6.0g/100mL，谷氨酸钠14.5g/100mL，冻干存活率为81.59%。本文研究成果存活率91.6%不低于以上研究成果，本试验得到的复配剂配方具有一定的借鉴意义。

3.2 耐高温考察

本实验对冻干后的菌粉在4℃冷藏保存10d，与0d相比存活率为98.96%，冷藏保存数据稳定，在37℃、42℃下高温保存10d，存活率分别为4.48%和1.22%。董佩佩等研究，通过对九种耐热保护剂的筛选出2%谷氨酸钠组对植物乳杆菌的保护效果略好，37℃条件下10d存活率为0.61%，42℃条件下10d存活率为1.92%（董佩佩等，2018）。与本实验结果4.48%和1.22%比较，结果相当。

4 小结

本研究得出植物乳杆菌保护剂最佳配方组合为：13%脱脂乳、4%海藻糖、3%乳糖、1%半胱氨酸。在最优配方保护剂下存活率为91.6%，最高活菌数为6.70×1010CFU/g，本研究仅对冻干保护剂的配方进行优化，未对冻干工艺参数进行深入化整体性的优化，因此，后续可以通过对冻干工艺参数的优化，以达到进一步提升菌粉活菌数目的。为下一步开发商品化专用直投式发酵菌剂提供技术支撑，为益生菌新型饲料的开发提供参考。

参考文献：（略）