男性不育患者Y染色体AZF微缺失和外周血染色体核型分析

张 巧 雒 瑶 祝建疆 蔡莉蓉 闻小慧 曾 雯 唐国栋 戚 红

北京市海淀区妇幼保健院(100089)

30%男性不育是由于遗传疾病，包括非整倍体、染色体结构异常、DNA损伤和基因突变，以及各种新发现的基因[1-2]。位于Y染色体上的AZF基因，也被称作无精子症因子，被发现其片段缺失与男性无精子症或严重少精子症有紧密的联系[3-4]。本研究采取多重PCR技术对392例原发男性不育患者外周血提取的基因组DNA进行AZF检测并进行染色体核型分析，分析原发不育患者Y染色体AZF微缺失和染色体核型异常情况，以探讨其与男性不育之间的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年7月-2021年7月本院收治的392例原发男性不育患者，平均年龄32岁(21～55岁)，其中无精子症患者80例，严重少精子症312例。经患者知情同意，抽取肝素钠抗凝血和EDTA抗凝血各2ml，分别用于染色体核型分析和AZF基因检测。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA提取采用基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)抽提DNA，用微量紫外可见分光光度计测定DNA的浓度及纯度。

1.2.2 Y染色体微缺失检测利用Y染色体微缺失基因检测试剂盒(深圳亚能生物技术有限公司)对AZF区内的15个序列标签位点(STS)进行检测，其中6个确定分区的STS，包括AZFa区：sY84、sY86；AZFb区：sY127、sY134；AZFc区：sY254、sY255。还有8个确证是否整段完全缺失的STS，包括AZFa区：sY82、sY1064、sY1065、sY88；AZFb区：sY105、sY121、sY1192、sY153。另外还包括一个异染色体标签sY160。其中，SRY基因作为性别异常对照，人类锌指蛋白基因ZFX/Y作为实验内控。PCR体系及扩增参照试剂盒说明，用凝胶成像系统(美国ALPHA INNOTECH公司)观察拍照并分析结果。

1.2.3染色体核型分析肝素钠抗凝外周血0.5ml接种于淋巴细胞专用培养基(上海乐辰生物科技有限公司)中，37°孵育72h，秋水仙素处理并常规制备G显带，显微镜油镜下进行染色体核型分析。

1.3 统计学分析

数据采用统计学软件SPSS22.0进行处理。组间比较采用χ2检验。以P<0.05为统计学意义。

2 结果

2.1 AZF 微缺失发生情况

在392例原发性男性不育患者共发现27例Y染色体AZF基因微缺失， Fisher精确检验统计无精症和少精症患者有差异(P<0.05)。AZF不同区域微缺失率中c区最高，其次是b+c区，b区 为0。 见表1。

表1 无精症与少精症患者Y染色体AZF区域微缺失发生情况比较[例(%)]

2.2 染色体异常核型检出情况

392例原发不育患者中共发现有17例(4.3%)染色体核型异常，其中无精症7例(8.8%)，少精症10例(3.2%)。见表2。

表2 原发男性不育患者染色体异常和多态检出情况[例(%)]

分类 少精症 无精症 平衡易位 46,XY,t(3;5)(p13;q33)1(0.3)0(0) 46,XY,t(7;8)(p15;q24.1),15ps+1(0.3)0(0) 46,XY,t(1;12)(q21;q23)1(0.3)0(0)倒位 inv(9)1(0.3)1(1.3)染色体多态常染色体多态性 1/9/16qh+/ps+4(1.2)2(2.6) Yqh+/Yqh Yqh+1(0.3)1(1.3) Yqh 1(0.3)0(0)

3 讨论

精子产生障碍是男性不育的重要因素之一，其中位于Y染色体长臂的无精子症基因AZF被研究发现能够控制精子的发生[5]。AZF的微缺失能够引起精子发生障碍，被认为是不孕男性精子发生失败的第二大常见遗传原因[6-7]。 本研究对就诊的392例无精症及少精症患者进行AZF基因微缺失检测，AZF总缺失率为6.9%,其中无精症患者缺失率为18.7%；少精症患者缺失率为3.8%。虽低于Liu等[9]AZF的总缺失率及少精症患者缺失率，但是无精症患者缺失率高于Liu等[9]的报道。

AZF区域是Y染色体微缺失片段中的好发部位，是目前唯一一个预测生精条件的指标。经典分类中，AZF被分为AZFa、AZFb及AZFc区[8-9]。根据目前研究报道，AZF基因区域的6个序列位点，其中包括有AZFa区的sY84、sY86位点；AZFb区的sY127、sY134位点；AZFc区的sY254、sY255，这些位点的缺失所致的男性不育，占所有AZF微缺失的95%[10-12]。本研究采用多重PCR技术，对不育男性患者不同区域AZF微缺失的发生率进行比较，结果显示，AZFc区微缺失率为2.8%，占本次检测的所有微缺失的40.7%，在所有AZF微缺失中发生率最高，提示AZFc区缺失对精液质量的影响更有相关性，与文献报道一致[13]。本次检测中，欧洲男科协会和分子遗传质量协作网(tEAA/EMQN)推荐用于确证AZFb完整性[10]的sY1192位点的缺失比例也较高，其中10例sY1192位点缺失，占本次检测的37.0%，1例sY1192和sY153缺失，未发现b区经典位点的缺失。sY1192位点在AZFb区和AZFc区重叠区域[14]，并且研究报道，AZFc区发生部分缺失时，常伴有sY1192缺失[14-16]。因此，位点sY1192的缺失，可能提示样本存在AZFc区的部分缺失，对于精子生成影响程度仍需进一步研究。

性染色体数目异常是引起男性不育的常见原因之一。性染色体数目异常一般多引起减数分裂或后合子发育的早期阶段出现异常，从而影响所有子细胞活性，或影响部分子细胞而引起的嵌合[17]。本组患者中性染色体数目异常8例，其中47,XXY 5例；48,XXYY 1例；45,X[27]/46,XY,Yqh-[73]嵌合型1例；47,XXY[4]/46,XY, [96]嵌合型1例。47,XXY核型表现症状即为Klinefeiter综合征，是性染色体数目异常中常见类型。研究发现，多余的X染色体影响睾丸发育，导致成年男性不育症和性腺功能低下[18]。嵌合体则是在减数分裂过程中X染色体分离不规律所致，其中两种细胞类型的比例大小则直接影响疾病的严重程度。

除了性染色体外，常染色体异常也是男性不育的原因之一。研究发现，常染色体上存在影响精子活性的基因，易位或者倒位则可能破坏调控精子发生基因的完整性，从而影响精子的生成[19]。 本文中常染色体异常共8例，其中包含有倒位，平衡易位及罗伯逊易位。

综上所述，Y染色体AZF基因微缺失及染色体异常是影响精子质量的重要因素，临床上通过相对应的检测，可以找到男性不育的原因，避免不必要的药物及手术治疗，对于男性不育患者诊断及治疗的改善有着重要的意义。